不同剂量氯沙坦治疗大鼠门脉高压性结肠病的实验-研究 (1).pdf

山西医科大学硕士学位论文 视。本实验中，将对NOS在结肠黏膜以及黏膜下层中的表达进行研究，以进～步探索其在 重要的炎症介质，参与机体多种生物学效应，对肝硬化患者高动力循环的形成和维持有重 要作用。本实验对血清TNF．Q含量进行测定，以明确氯沙坦对血清TNF．Q含量有无影响， 进一步探索氯沙坦对PHC的治疗机制。 2 材料与方法 1实验动物 成年雄性Wistar大鼠92只，体重200．2509，购于山西医科大学实验动物中心。 2主要试剂和仪器 2．1四氯化碳(CCL4)：天津化学试剂厂产品。 2．2氯沙坦： C科素亚)杭州默沙东制药有限公司。 ‘ 2．3诱导型一氧化氮合酶(iNOS)免疫组化试剂盒：北京中杉生物技术有限公司。 2．4内皮型一氧化氮合酶(eNOS)免疫组化试剂盒：北京中杉生物技术有限公司。 2．5肿瘤坏死因子(TNF．a)放免测定试剂盒：北京普尔伟业生物科技有限公司。 2．6一氧化氮试剂盒：南京建成生物工程研究所。 2．7B12000计算机图像分析系统：成都泰盟科技有限公司。 2．8JEM．100CX透射电镜：山西医科大学电镜室。 2．9BIAl0生物机能实验系统：成都泰盟科技有限公司。 2．10 Uu2102C型分光光度计：尤尼柯(上海)仪器有限公司。。 2．11OLYMPUS BH．2显微照相系统：日本奥林巴斯光学工业株式会社。 3实验动物分组及标本预处理 3．1动物模型的制备 采用复合因素法制备大鼠肝硬化模型113l：试验第一天，皮下注射60％CCl4油溶液， 按0．5ml／1009体重计算，以后每隔3 重计算。饲料前两周为79．5％玉米面，20％猪油，0．5％胆固醇混和饲料，从第三周起改为 99．5％玉米面，0．5％胆固醇。10％酒精为其唯一饮料，造模时间持续8周，明确门脉高形 成后，在治疗期间继续致病因素干扰3周。 3．2实验动物分组及用药方法 组，采用普通饮食，余76只大鼠采用复合因素法制作肝硬化模型，造模期间大鼠死亡23 肝脏右叶组织经10％甲醛固定，常规石蜡包埋。肝脏病理切片用HE染色，观察各期的肝 脏病变，明确造模成功与否，有无门脉高压形成。 药物溶解于蒸馏水中，按lml／1009体晕灌I’』，lr常对照组、模型对照组以等量蒸馏水灌胃。 灌胃时间为早8：oo，治疗时间为3周。；们，结束后进行各项指标的测定。用药期例模型 山西医科大学硕士学位论文 对照组、治疗组继续采用复合因素法的致病因素干预。 3．2测压及标本采集 3．2．1测压步骤 治疗结束后，正常对照组无死亡，模型对照组死亡3只，高剂量治疗组死亡1只，低 体重剂量麻醉。右颈部正中切口，钝性分离皮下组织，于气管旁分离右颈总动脉，分离迷 走神经，后行右颈总动脉插管测量平均动脉压(MAP)。肝静脉压测量由专人操作，参考 套管测量法【14】，上腹正中切口，游离肝静脉，用套管针刺入肝静脉一分支中，退出针头， 将一细导管通过先行插入的大导管插入肝静脉分支，继续插管至肝静脉-d,分支中，待压 HVPG数据弃之不用，停止操作迅速用血管夹夹闭止血，进行以下操作。 3．2．2标本留取预处理 取各组降结肠组织以10％甲醛固定，常规石蜡包埋。另取模型对照组、正常对照组、 高剂量治疗组结肠组织，用2％戊二醛固定两小时，放入0．1mol／L二甲砷酸钠缓冲液内， ℃保存。 4检测方法及步骤 4．1HE染色及图像分析 结肠组织常规包埋，劬m病理切片后用HE染色，观察各期的结肠黏膜的变化，同时 观察氯沙坦治疗组结肠黏膜病变有无改善，·并用图像分析系统分析黏膜下微静脉面积、单 个毛细血管内表面面积。光镜下随机测量每张标本每个视野中5条微静脉的长径及短径分 别取其平均值，用这两个数的乘积表示微静脉扩张程度的量化指标；每张标本随机抽取5 个毛细血管，分别测量其内表面面积，取其平均值作为该标本毛细血管扩张程度的量化指 标。 4．2免疫组化染色 蒸馏水冲洗后，PBS液浸泡5分钟，使用微波炉修复：将玻片置入0．01m枸橼酸溶液中，在 微波炉中加热至沸腾后，停止加热，静置10分钟，后继续加热到沸腾