生物化学实验课件-淀粉酶活力测定).ppt

　　　 C：标准盐酸溶液摩尔浓度(0.01)。 V1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。 V0：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。 W：样品重量（mg）。 14.01：氮的原子量。 K=5.7 M=12.5% V2=100ml V3=5ml 五、结果计算 实验六 甲醛滴定测氨基氮 一、实验目的 1．加深对氨基酸两性解离的认识。 2．掌握甲醛滴定法的原理及应用。 三、实验仪器、试剂及材料 1. 实验仪器： 微量碱式滴定管（10ml）、 2. 试剂： (1)．0.5％酚酞指示剂：。 (2)．1％甘氨酸即1克加100ml水配制而成 (3)．0.1mol／L标准氢氧化钠溶液（使用前需标定）。 (4)．中性甲醛溶液：取分析纯甲醛(36％～37％)溶液20ml，加0.5％酚酞指示剂约3滴，滴加0.100mol／L的氢氧化钠溶液，使溶液呈微粉红色（临用前中和）。 氨基酸为两性离子，在水溶液中有下列平衡： RCHCOO- +2HCHO ＝ RCHCOO- + H+ ↓ ↓ NH3+ N(CH2OH)2 常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，使上述平衡右移促使NH3+释放H+，从而使溶液酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH值9.0左右），根据滴定终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混合物，则只能算出其氨基氮的含量。 二、实验原理 四、操作方法 已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定: 取3只三角瓶编号①2ml 1% 甘氨酸②2ml 1% 甘氨酸③2ml 水（空白） 均加5ml 水和5ml中性甲醛（用前加2滴 0.5% 酚酞滴加0.1mol/LNaOH调至淡红色），及4滴 0.5%酚酞混匀→用0.1mol/L滴至粉红色出现为止→分别记下耗去标准碱的体积(V1.V2.V0） 五、结果处理与计算 式中：V：滴定样品所消耗标准碱的平均体积（ml）。 V0：滴定空白所消耗标准碱的体积（ml）。 C：滴定时用标准氢氧化钠的浓度（0.1mol／L）. 14.01：lml lmol／L氢氧化钠相当于氮的质量（mg）。 说明： 1.本法优点是简单快速，缺点是不够准确，其准确度仅达到氨基酸或氨基氮理论含量的90％。而且，如果样品液中含有脯氨酸或酪氨酸时滴定误差更大，因为脯氨酸与甲醛作用后生成不稳定化合物使结果偏低，酪氨酸的酚基结构又使结果偏高。 2．甲醛滴定法常用以测定蛋白质的水解程度。 3．中性甲醛需临用前配制。放置一段时间后，在使用前需重新中和。 六、思考题 为什么说甲醛滴定法可以测定蛋白质的水解程度？除此之外还有哪些方法可以用来测定蛋白质的水解程度？ 实验七　酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定 一、实验目的 （1）了解并掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。 （2）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。 （3）掌握地衣酚显色法测定酵母RNA含量的原理和方法 二、实验原理 酵母含RNA达2.67—10.0%，以酵母为原料使用稀碱使酵母裂解，然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA。由此得到的RNA为变性的RNA，可用作制备核苷酸的原料。 用硫酸水解RNA后,可生成磷酸、戊糖和碱基,各成分用以下反应加以鉴定：（1）磷酸与钼酸铵试剂作用可生成黄色磷钼酸铵沉淀。（2）核糖与地衣酚试剂作用呈鲜绿色。（3）嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。 RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3， 5-二羟甲苯（地衣酚或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20－250微克范围内，光吸收与RNA浓度 成正比。 三、仪器和试剂 1. 主要试剂 （1）酵母粉 （2）0.04M NaOH溶液 （3）1.5M硫酸 （4）无水乙醚 （5）95％乙醇 （6）浓氨水 （7）酸性乙醇溶液 （8）浓硝酸 （9）0.1M AgNO3 （10）三氯化铁-盐酸溶液。 （11）钼酸铵试剂 （12）50ug∕㎎RNA标准溶液 （13）苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液 （14）地衣酚-铜离子试剂 （15）0.001M NaOH