常见的赵明明-磁珠纯化的原理.ppt

磁珠纯化的原理 胶回收—玻璃奶法 玻璃奶的制作 1.石英砂磨成325目的玻璃粉（研磨2小时左右）;粉末颗粒的大小，指的是粉末可以通过325目的筛网 2. 50克玻璃粉悬于加有200mL蒸馏水的烧杯中,搅拌混匀后,静置90min; 3.将上清转移至离心管中6000g离心10min; 4.倒掉上清,将玻璃粉重悬于1.5mL 25%的硝酸中,室温放置过夜; （新购置的玻璃器皿含有较多的游离碱，需要在酸中浸泡数小时，浸泡后再冲洗干净） 5. 6000g离心10min,沉淀玻璃粉; 6.倒掉上清,将玻璃粉用无菌双蒸水洗涤4-6次,直至pH值中性; 7. 用无菌双蒸水重悬玻璃粉,配成50%匀浆; 8.等分成100μl样品, 贮存于-70℃;待用的样品可贮存于-20℃或4℃. 切取目的DNA条带 溶胶 结合玻璃奶 离心沉淀玻璃奶 洗脱DNA 漂洗玻璃奶 操作步骤 原理 玻璃奶(Glassmilk) 是一种白色硅颗粒，能结合0.2kb至50kb大小的DNA（双链、单链、线性、环状或超螺旋）。 DNA与玻璃奶结合原理 在高盐状态下，玻璃奶周围的负电荷被打破，并允许DNA的磷酸负电荷与玻璃奶特异性结合。在低盐（H2O或1×TE）时溶解分离。 盐浓度 DNA100bp:高盐状态下结合率高。 DNA100bp:低盐状态下结合率高。 pH值 pH7.0:结合率高。 磁珠种类 磁珠：超顺磁性纳米颗粒 硅磁（Magnetic Silica Particle）：磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。 氧化硅羟基磁珠：此种微球具有核壳结构，即超顺磁性核心及无机氧化硅外壳，表面修饰大量硅烷醇基团。硅烷醇基团（羟基）在chaotropic（如盐酸胍、异硫氰酸胍等）存在的条件下，能够和溶液中的核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合，而不与蛋白和其他杂质结合。 氧化硅羧基磁珠：该磁珠表面修饰有羧基官能团，能够在特殊化学试剂（如EDC）的作用下将蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到磁珠表面，可应用在蛋白纯化、核酸纯化、亲和层析、细胞分类筛选、免疫测定分析和临床诊断等多个生物领域。 SA磁珠（Fe3O4/SiO2/SA)：利用生物纳米表面技术，使重组Streptavidin高密度定向包被到超顺磁性微球表面，其在表面的包被密度高达9.3×1013 molecules·cm-2，排列均匀，并朝向一致。产品具有较高的生物素结合效率和较低的蛋白及DNA非特异吸附率，每毫克磁珠结合游离生物素的量可达到1200 pmol以上。 磁珠品牌 Agencourt Bioscience Corporation（Beckman Coulter Company） Agencourt AMPure XP beads Bruker Daltonics GenoPure ds Genopure oligo（single-stranded DNAs） Macherey-Nagel NucleoMag® 96 PCR Omega Mag bind NGS Clean-IT 96 Kit NEB NEBNext Oligo d(T)25 Magnetic Beads NEBNext Protein A Magnetic Beads Agilent Streptavidin T1 magnetic beads 磁珠选择大小 样品起始100μl，0.55× 去除大片段后155 μl，0.16× large target What plays the role in size selection is not AMPure beads, but its buffer. 磁珠选择大小 stock buffer: 20% PEG 8000, 2.5M NaCl, Tris 磁珠选择大小 Roche 磁珠选择大小 12 μl product was mixed with 12 μl of ‘‘12p XP’’ beads and incubated at RT for 6 minutes. The supernatant was then mixed with 12 μl of AMPure XP beads and 5 μl of 40% of PEG8000 and eluted with 10 μl of nuclease-free water, it was then again purified using 12 μl of AMPure XP beads and eluted in 30 mL of