流式术-研-(精选·公开·课件).ppt

流 式 细 胞 术 流式细胞术和流式细胞仪概念 流式细胞仪工作原理 流式细胞术的数据获取和分析 流式细胞术的应用 流式细胞术的样本处理 流 式 细 胞 术 (Flow Cytometry FCM) 一种定量分析技术； 利用流式细胞仪检测细胞特异标记的荧光信号，从而测定细胞的多种生化物质（膜表面受体、抗原、离子或DNA/RNA表达等）特性的方法； 是一项可以把具有相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多种细胞群体中分离和富集出来的细胞分析技术。 流式细胞仪 是一种集多种技术为一体的新型高科技仪器。 激光技术 电子物理技术 光电测量技术 电子计算机技术 细胞荧光化学技术 抗体技术 流式细胞术特点 分析对象：单个细胞或单个生物微粒（ 人工合成微粒、染色体、微生物等）； 分析速度：一般机型达到3000~6000 Cell/sec （MoFlo XDP 最高达10,0000~27,0000Cell/sec ）。 检测参数：6~20（4色~18色） 应用流式微球芯技术（CBA）同时检测多种可溶性细胞成分。 检测结果：精度高（灵敏度600个荧光分子；分辨率-变异系数CV值2%），准确性好。 先进的定量技术。 分选细胞纯度99%；细胞活性80~95% 流式细胞仪分类 临床型—以分析为主。仪器特点：光路调节系统固定，自动化操作程度较高，适用于临床常规测试。 科研型：分辨率高，可选配多种波长和类型激光器（3激光-9色），细胞分选功能。 流式细胞仪机型-BD公司 分析型 BD FACSCalibur BD FACS Canto II FACSVantage SE 流式细胞仪机型-BD公司 分选功能 BD FACS Aria II BD FACS Aria III BD Influx COULTER Epics XL流式细胞仪-分析型 流式细胞仪-Beckman Coulter CytomicsTM FC 500 ---分析型 采用单激光或双激光激发方式，可进行5色分析。 流式细胞仪-Beckman Coulter 分选型 MoFlo XDP超速流式细胞分选系统? 流式细胞仪内部结构 *光学系统 激光系统（激发波长）： 激光器：气体（氩离子-488/355nm、氦氖-633nm、氪离子-647nm和氪氩-568nm）、染料和半导体。仪器可选配2~4根激光器。可检13色。 光收集系统（发射波长）：滤光片 长通滤波 （LP）：500nm、540nm（弱） 短通滤波 （SP）：460nm、500nm（弱） 带通滤波 （BP）：460nm（弱）、500nm （XL型有4个荧光通道） 激光光束成形器 四色荧光的滤片系统 光 学 系 统 流式细胞仪内部结构 液流系统： 流动室：被检测样品在此与激光相交 流动驱动系统：空气泵+压力穿传感器 鞘液 液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱 流动系统  流式细胞仪内部结构 电子系统： 光电转换系统 前置放大电路：输出脉冲信号 光电转换器：将光信号转换为电信号 光电二极管：光灵敏度低，测定强信号-FSC 光电倍增管（PMT）：放大电信号，光灵敏度 高，测定弱信号-SSC、FL1~FL4 数模转换电路：将模拟的峰值转换为数字信号 数据处理系统：--计算机系统采集数据和分析 流式细胞仪内部结构 细胞分选系统：喷嘴，电偏转板和样品收集器。 分选方式： 通道式分选 电荷式分选 流式细胞仪信号检测原理 信号类型 散射光信号： 前向角-FSC：1~6o角散射光，与细胞大小有关 侧向角-SSC：90o角散射光，与细胞精细结构和颗粒性质有关，对细胞膜、细胞质和核膜变化更敏感。 荧光信号：自发荧光，特异荧光 流式细胞仪工作原理 荧光染色的细胞 激光束照射 散射光 荧光 前向角散射光(FS) FL1~FL4 侧向角散射光(SS)  FSC可反映被检细胞体积的大小; SSC反映细胞内部结构密度高低。 常用荧光染料 激光器 荧 光 染 料 氩离子（L1) 绿色 FITC Alexa Fluro488 (488nm) 黄色 PE