第二章 沉淀法（修订版）.ppt

3. 盐析的影响因子 （1）盐析常数（Ka） 蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度的关系为：溶解度（S，以mg/ml表示）的对数值与溶液中盐的浓度（M）成反比例关系，可用公式表示： lgS＝β-Ka· M 式中β表示有效成分在水中溶解度的对数值；M表示克分子浓度； Ka表示有效成分在特定条件下的数值，即表示有效成分的溶解度降低的速率是随着盐浓度的增加而增加的。 * Ka值大，则意味着有效成分溶解度降低的速率快。 因此，对一种有效成分而言，Ka值越大，分级范围越窄。盐析效果就越好。 某一蛋白质的Ka值： 与蛋白质本身的性质有关 与溶液的pH、温度和盐的种类等有关 * (2)盐的分级范围的差异性 当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的Ka值都很大，而且盐析范围（盐离子强度）差异明显，则分离效果好；若Ka值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果不好。 * (3) pH和盐浓度 溶解度与pH和盐浓度有密切关系。当这两种因子变动时，溶解度将发生明显的变化。 选择适当pH的盐溶液，可提高对有效成分的盐析效果。 另外，硫酸铵水溶液显酸性，为防止其对某些蛋白质的破坏，应及时用氨水调pH至中性或视有效成分的pH而定。 * (4) 蛋白质的纯度和浓度 蛋白质存在的形式和浓度不同，盐析范围和溶解度也不同。 在混合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀现象。蛋白浓度越高，这种现象越明显，盐析分离效果则越差。 因此，一般控制样品液蛋白浓度在0.2％-2％为宜。 * (5) 其它 在溶液中加1mmo1/L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。 或控制加硫酸铵沉淀的时间，一般二小时左右。 * 4．脱盐 常用方法：凝胶过滤法和透析法 具体操作：是把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋，扎紧袋口（袋内留适当的空间）。漂在水或适当的透析液中。要防止透析液从袋口进入，以免引起透析袋胀裂。 盐离子和小分子物质将穿过半透膜由高向低进行扩散渗透，而蛋白质等则留在袋内。 不断更新透析液，若用温和搅动的办法则效果较好；为了避免蛋白质或酶类破坏，在低温下进行。 * 透析时注意： （1）透析袋的处理 新的透析袋用蒸馏水洗净，无漏洞时，即可使用。 除去透析袋中所含盐类时，处理方法： 将透析袋置500毫升含1mmo1/L EDTA-Na2的2％碳酸氢钠溶液中煮沸10分钟，用干净镊子或戴橡皮手套取出，蒸馏水煮沸、漂洗后，可使用。用过的透析袋同样处理后，能重复使用。 保存：泡在蒸馏水中置低温（4℃）或泡在70％的乙醇中保存。 * （2） 选用适当的透析液 一般选用：低离子强度的中性缓冲液对含有辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为了防止微生物生长，透析应在4℃进行或在透析液中添加0.02％叠氮化钠。 * (3) 掌握透析时间 搅拌下进行，样品液与透析液体积之比以1:10较好，一般三小时。 在静止状态下过夜进行时，则比例应扩大到1:20以上。 * 盐脱是否彻底，要经常检查： 除去硫酸铵，可用10%氯化钡检查 除去氯化钠，可用10％硝酸银检查 透析液中检测不出现硫酸钡或氯化银沉淀，即透析完成。 * 二、有机溶剂沉淀法 有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因：（1）与盐溶液一样具有脱水作用 （2）有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小常用的有机溶剂：甲醇、乙醇和丙酮 * * happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day happy every day 第二章 沉淀法 * 沉淀法（溶解度法）—是纯化生物大分子物质常用的一种经典方法优点：操作简单，成本低廉分类：盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀 * 第一节 基本原理 原理： 根据各种物质的结构差异性（如蛋白质分子表面疏水性基团和亲水基团之间的差异性）来改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），进而导致有效成分的溶解度发生变化。 *  一、盐析法 原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。 原因：盐浓度增高到一定数值时，使水活