高效液相色谱仪操作.pdfVIP

液相色谱使用及注意事项 (注：使用HPLC 前请充分理解本protocol ， 首次使用请在熟悉HPLC 的人员指导下进行) 一：高效液相色谱仪 （HPLC ）的组成和各个部件的功能简介: HPLC 由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、信号采集等五大 部分组成。分析前，检查是否是合适的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱 子达到平衡而且基线平直后，用液相专用微量平头进样器进样，流动相把样品带 入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起 排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信 号，经过放大，信号采集输出至电脑经过处理形成色谱图。色谱图是定性、定量 和评价柱效高低的依据。 高压输液系统：高压输液泵是HPLC 关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的 流动相以高压形式连续稳定送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 进样系统：包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入 色谱柱中进行分离。 分离系统：包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈 钢制成，其内径为2 ~ 6mm ，柱长为10 ~50cm，我们柱温箱可以使用小于300 mm 色谱柱，内部充满微粒固定相，柱温根据文献设定。 检测系统：荧光检测器和紫外检测器 荧光检测器 (Fluorescence Detector,简称FLD) 是HPLC 常用的一种检测器。用紫 外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出。选择性高，只对荧 光物质有响应;灵敏度也高，适合于多环芳烃 （PAHs ）及各种荧光物质的痕量分 析。每种物质对应特定的激发波长和发射波长，根据参考文献进行所测样品的两 个波长设置。 紫外检测器（Ultraviolet Detector ）是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测 器，其工作原理是Lambert-Beer 定律，即当一束单色光透过流动池时，若流动相 不吸收光，则吸收度A 与吸光组分的浓度C 和流动池的光径长度L 成正比。物 理上测得物质的透光率，然后取负对数得到吸收度。大部分常见有机物质和部分 无机物质都具有紫外或可见光吸收基团，因而有较强的紫外或可见光吸收能力， 因此UVD 既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围，是液相色谱中应用最广 泛的检测器。每种物质对应特定的吸收波长，根据参考文献进行所测样品的两个 波长设置。 信号采集：液相色谱工作站对检测器信号进行采集，集成处理数据，形成色谱图。 二：操作规程-方法建立-数据处理 操作过程： 在开机之前，根据所做样品的方法要求，准备好所用流动相，标样及样品。流动 相0.22µm膜抽滤后超声脱气30分钟。A 、B两相中，则A管道连接蓝盖瓶的水相， B管道连接蓝盖瓶的有机相。确保每天用重新超声和超滤过的水和有机相。所有 样品过膜（0.22或0.45µm滤膜）后使用。 开机步骤： 依次打开电脑→泵→柱温箱→检测器→打开LC solution→点击“1分析”听见“滴 滴”两声待自检通过→打开“文件”中“方法文件夹”调出方法，平衡压力30 分钟左右即可进样。 进样步骤： 打开左栏框内“单次运行”→载入“方法文件”和“数据文件”后点击“确定” →进样阀上扳、进样打针、下扳、取针，自动开始走样。 关机步骤： 试验结束后用水相（有盐离子时必须用水冲洗干净时间最少1小时）或有机溶剂 冲洗管道（半小时以上），冲洗结束后分两种情况： 1，第二天继续做样：流速调小约0.1ml/min （确保AB两相不能走空，蓝盖瓶内溶 液足够）→关闭检测器光源→关闭柱温箱（第二天做实验依次打开柱温箱和检测 器光源） 2，长期不用：根据色谱柱保存要求进行封柱（如PAHs专用柱：用100%乙睛1.0 ml/min冲洗1个小时左右）→关掉检测器光源→关掉仪器→关软件（“滴”一声） →关泵→关电脑。 方法建立： 建立色谱操作方法： 建立色谱操作方法（参数设置：流动相AB 比例，流速，柱温箱，波长的设 置）。注意保存为自己命名的Method ，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果； 标准曲线的建立： 配置一系列标准浓度梯度的标液，一般采取逐级稀释的方法（5-8 个点）。具 体步骤参照仪器使用说明P18-P24 页。 数据处理： “再解析”里读取最终浓度，誊抄到自己的记录本上。 三：HPLC 操作注意事项 1, 排气泡 如何排出Teflon 管道内气泡： 排空操作：打开LC-20AT泵排空阀（逆时针90度以上），按Purge键