酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理.docVIP

月亮县 中医院 项 目 文件编号：YCXZYYJYK_SOP_13 页码：第 5 -页，共 NUMPAGES 5页 检验科 免疫SOP手册 版本：第3版，第1次修订 生效日期PAGE 编写者：张三三 审核者：李四四 批准者：李四四 时 间时 间时 间SOP_13-1 酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理与注意事项 一、基本原理 1、包被 1.1、固相载体的要求 （1）、结合抗体或抗原的容量大 （2）、抗体或抗原牢固地固定在其表面 （3）、不影响免疫反应性 （4）、利于反应充分进行 （5）、固相方法简便易行，快速经济 1.2、固相载体的材料：聚笨乙烯 1.3、包被coating 将抗原或抗体结合于固相载体。 1.4、封闭blocking 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。 2、反应 加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。 标记酶的要求： (1)、活性高 (2)、性质稳定 (3)、专一性强 (4)、酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5)、方法敏感，重复性好，简单易行 (6)、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 常用酶 辣根过氧化物酶HRP（ELISA中应用最为广泛的标记用酶） 3、洗涤 使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。 4、底物显色 HRP DH2+H2O2—————→ D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。 常用底物：四甲基联苯胺TMB 四甲基联苯胺TMB是ELISA中应用最广泛的底物。TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性。 二、常用方法与原理 1、双抗体夹心法 方法： 用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等 2、双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似双抗体夹心法 应用：乙型肝炎表面抗体 3、竞争法（测抗原） 方法： 用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用： 用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） 4、竞争法（测抗体） 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 5、间接法 方法： 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点： 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 应用： 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。 6、捕获法 方法： 抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体→加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物→显色 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体、 甲型肝炎HAV-IgM抗体 、 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体