质粒提取最终版1.ppt

质粒DNA的提取 及琼脂糖凝胶电泳 基因克隆简介 目的基因 载体 酶切，连接 重组基因 转入 受体细胞 筛选阳性克隆 基因克隆流程图 基因克隆简介 分 切 接 转 筛 二.载体 定义：载体是一类能将外源基因携带进入受体细胞 并能自我复制的DNA分子。 结构的三要素 多克隆位点 遗传标记 复制起点 包含多个限制性酶切位点的DNA片段 载体种类： 质粒 噬菌体载体 酵母人工染色体（YAC） 病毒载体 常用的克隆载体 三.质粒 （一）定义：质粒是独立存在于细菌染色体外的， 能独立复制的环状双链DNA分子。 （三）质粒的构型 1. 超螺旋DNA （supercoiled DNA, sc DNA） 超螺旋 2.开环DNA (open circle DNA, oc DNA) 开环DNA 3.线形DNA（linear circle DNA，lc DNA) （四）与本实验有关的两种质粒 1.PBR322(作为目的基因供体) orii ampr tetr 2.PUC18(作为载体） orii 实验目的 1.掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法。 2.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。 实验原理 （一）碱裂解法 碱裂解法是利用质粒DNA和染色体DNA 之间变性和复性的差异而达到分离目的 。 强碱及机械剪切力 ①染色体DNA断裂成小片段线性DNA（机械剪切力) ②染色体氢键断裂，双链解离变性（强碱）； ①质粒DNA保持闭合环状； ②双链DNA并未完全分离（强碱）。 酸中和至中性 变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物 质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 二.琼脂糖凝胶电泳 回顾： 1.电泳的定义及影响电泳的因素？ 2.醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的原理？ 琼脂糖凝胶电泳分离DNA原理 点样孔 超螺旋DNA 线形DNA 开环DNA 带电颗粒在电场中泳动的速度 由于电场力的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动；此颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f·υ)阻挡；当这两种力相等时，颗粒则以均匀速度(υ)向前泳动 点样孔 超螺旋DNA 线形DNA 开环DNA 带电颗粒在电场中泳动的速度 由于电场力的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动；此颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f·υ)阻挡；当这两种力相等时，颗粒则以均匀速度(υ)向前泳动 式中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的黏度，即 式中 f——阻力，牛顿； r——粒子半径，米； ——介质粘度，牛顿·秒/米2； 从公式看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质黏度成反比 电泳迁移率 电泳迁移率（mobility）:在电位强度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。 d 为带电颗粒泳动的距离(cm)； l 为支持物的有效长度(cm)； t为通电时间(秒)； V为加在支持物两端的实际电压(V)