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第三节免疫检测技术的基本原理 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原 . 将免疫反应与现代测试技术结合 超微量的检测 免疫学检测技术的优点 高度的灵敏性 高度的特异性 免疫分析技术的应用 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术 凝集试验 概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。 1.直接凝集反应 抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳性结果。 ①玻片直接凝集法：定性试验 ②试管直接凝集法：半定量试验 试管法半定量试验 2.间接凝集法 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上(如RBC, 乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗原反应，出现凝集为阳性结果。 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试验等。 3.间接凝集抑制试验 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。 凝集反应 免疫标记技术 酶免疫标记技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 免疫金标记技术 酶联免疫吸附试验 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法 食源性病原菌检测试剂盒 大肠杆菌检测 沙门氏菌检测 单增李斯特菌 金黄色葡萄球菌 荧光抗体技术的原理与方法 用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中抗体或抗原反应，然后在荧光显微镜下观察，形成的IC可散发出荧光，对标本中的抗原或抗体进行测定和定位。 常用的荧光素 异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)等。 常用的方法 直接荧光法 间接荧光法 免疫荧光技术——直接法 免疫荧光技术——间接法 免疫荧光技术 免疫金标记技术 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。 一、胶体金制备 　胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。 胶体金的制备及特性 胶 体 金（Colloidal Gold）15~60 nm 胶体金结合物（Conjugate） 一、免疫渗滤测定(IFA) ? 斑点渗漏法 其原理与层析法相类同，中心圆点为一株单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株单抗，若有抗原则形成金-Ab-Ag?薄膜的红色斑点，而边上是金-Ab-Ab2?薄膜的质控点，是为金标二步法。 IFA——双抗体夹心法测抗原 IFA——结果判断 二、免疫层析测定（ ICA ） 层析法 将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解，并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形成Ag-Ab-金复合物，当上行至中段醋酸纤维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被固定下来，显示阳性结果。其上方还有一条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即被固定下来，作为金标单抗质控的提示。此种方法称金标一步法。 ICA——双抗体夹心法测抗原 ICA--- 竞争法测抗原 ICA 竟争法结果观察 ICA——间接法测抗体 ICA 结果观察 IFA与ICA的比较 IFA 穿流（FLOW THROUGH） ICA 横流（LATERAL FLOW） 3、 谌志强, 段惠莉, 王新为, 等. 大肠埃希菌O157:H7的胶体金免疫渗滤法检测[J]. 中国公共卫生, 2005, 21(4): 705-706. 4、 谢昭聪, 宋志强, 吕敬章, 等. 应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2005, 28(3): 163-165. R：放射性核素示踪 高灵敏 不直接探测待测物，而探测待测物上的标记信号 (标记物的放大效应)