hClock蛋白和P16蛋白在食管癌中表达及临床意义的研究.pdf

引言 1．近日钟节律基因hCloek和抑癌基因p16与细胞周期 人类的近日钟节律中枢位于神经中枢下丘脑视交叉上核处(SCN)，位于中枢的振荡 器或生物钟产生节律，起到调控节律的作用。最早人们研究其在抑郁症患者中的作用， 后来发现肿瘤、睡眠障碍等疾病患者中有表达。特别是在肿瘤中的研究取得了重大进 步。细胞周期是指连续分裂的细胞，从细胞分裂开始到下一次完成分裂为止，P16是细 胞分裂周期的一种基因，研究证明p16在乳腺癌、肺癌、脑肿瘤等发生甲基化，是这 些种类肿瘤中广泛存在的现象。 2．hCloek和p16与肿瘤治疗 hClock可通过调控相关基因的表达，在肿瘤发生过程中具有直接或间接的作用。 肿瘤细胞源于正常机体细胞的基因变异，由于癌基因的启动和抑癌基因的突变造成细 胞异常凋亡，使癌细胞丧失正常节律。研究证实肿瘤细胞同样有着节律性，癌细胞的 增殖和凋亡受自身节律的调控。许多研究证明并证实了某些化疗药物的治疗效果与用 药的时刻关系密切，据此有人提出时相化疗的观点并加以利用，目前已在某些肿瘤的 治疗上取得了良好效果。细胞周期的调控异常与肿瘤的发生更是密切相关，其中 肿瘤细胞获得了更大的生长优势【l¨。导入野生型p16基因及防止p16的异常甲基化可 能对某些肿瘤的治疗起到作用。 3．hCloek基因和P16与食管癌 P16与食管癌的关系国内外有较多研究，而hClock基因与食管癌的关系国内未见 报道，而hClock基因与结直肠癌及乳腺癌等的关系国内已有多人研究，并取得了 hClock基因在这些肿瘤演进中起作用的结论。由于P16目前已被推断为抑癌基因，而 hClock基因有人推断为癌基因，而且两者均参与细胞周期调控，研究两者在食管癌组 织及癌旁组织的分布关系，探讨它们在食管癌发生中起的不同作用，从而为食管癌的 发病原理提供理论解说，并为食管癌治疗寻找新的有效靶点。 材料与方法 第一章材料与方法 1．1材料来源 选取泰安市中心医院2012年12月．2013年5月，临床及病理学确诊的食管鳞状细 部术后病理证实为食管鳞癌，切缘均未见肿瘤累及。术前均无放疗、化疗及其它治疗史。 标本采集自肿瘤所在处中心的取材作为实验组，另自食管上切缘处正常食管组织(所有 癌旁正常组织均经高年资病理科医师确认无癌组织)取材作为实验对照，并且完整收集 例，N1：17例，N2：5例，N3：4例。病理分期：IA期2例，IB期6例，IIA期1例， II 织作对照研究。 1．2主要试剂 兔抗人hClock多克隆抗体(Uscnlife公司ELISAKitforClock SEQll6Hu) Homolog 鼠抗人P16多克隆抗体(SantaCruz公司) SP．9000通用型试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司) 1．3免疫组织化学染色(链霉菌抗生物素一过氧化物酶方法，S．P法)主要步骤： (1)首先将石蜡组织切片常规进行脱蜡至水 PBS连续冲洗3次，每次5分钟 (2)用0．01M (3)然后置于3％过氧化氢液中，在室温下孵育20分钟，达到封闭过氧化氢酶目的 (4)．再使用0．01MPBS反复冲洗3次，每次5分钟 (5)采用高压热修复法进行抗原修复。方法是将切片浸入PH6．0枸橼酸缓冲液，置 于高压锅内修复5分钟，取出切片后置于室温下冷却． (6)0．01MPBS反复冲洗3次，每次5分钟 (7)切片滴加少量山羊血清，再置于室温下孵育20分钟 (8)倾去山羊血清，分别滴加一抗工作液，400C孵育过夜 (9)用0．01MPBS反复冲洗切片5分钟3次 (10)滴加生物素标记的二抗，在室温下孵育20分钟 1 材料与方法 (11)PBS共冲洗5分钟3次 (12)滴加辣根酶标记的链酶卵白素，置于室温下孵育20分钟 (13)PBS冲洗5分钟3次 (14)DAB显色，置于显微镜下观察1．2分钟后终止反应 (15)自来水充分冲洗，苏木素复染 (16)酒精梯度脱水，二甲苯透明