GB/T 17480-1998饲料中黄曲霉毒素B1的测定　酶联免疫吸附法.pdf

GB/T17480-1998 前 言 酶联免疫吸附((ELISA)法测定黄曲霉毒素B,(AFB,)，是近20年来发展起来的一种新的分析方法。 它比原GB8381-87薄层荧光限量法(半定量)测定AFB，具有技术先进、灵敏度高、特异性强、精确度 高、重复性好、测定速度快、成本低、污染少等优点。其原理是通过AFB,抗体与酶标AFB,抗原和待测 抗原之间免疫竟争反应以及酶的催化显色反应相结合来检测样品中AFB，的含量。国外已研制成专门 的测试盒供检测部门使用，如美国Agri-Screen等公司就有这种产品。 本标准等效采用AOAC(美国公职分析化学家协会)中关于棉籽制品和混合饲料中AFB,酶联免疫 吸附筛选法，该法1989年首次在AOAC上获得通过。 本标准为饲料中AFB，限量和定量测定法.可与原GB8381-87标准并列使用，而以原标准为仲裁 法。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准由江苏省微生物研究所、上海市饲料质量监督检验站、国家饲料质量监督检验中心(北京)、 上海市嘉定纤检仪器厂共同组成的起草工作组负责起草。 本标准主要起草人:成恒篙,潘中华、张瑜、陈必芳、必晓黎、赵晓联、袁建兴、杨众、徐燕芳、葛其德。 中华人民共和 国国家标准 饲料中黄曲霉毒素Bl的测定 酶联免疫吸附法 GB/T17480-1998 DeterminationofaflatoxinB,in -Enzyme-linkedimmunosorbent 1 范围 本标准规定了饲料中黄曲霉毒素B,(AFB,)的酶联免疫吸附测定((ELISA)方法。 本标准适用于各种饲料原料、配(混)合饲料中AFB:的测定。 2 引用标准 GB8381-87饲料中黄曲霉毒素B，的测定方法 3 原理 利用固相酶联免疫吸附原理，将AFB,特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入样 品提取液(未知抗原)及酶标AFB，抗原(已知抗原)，使两者与抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酶底 物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标AFB,抗原结合的量，即样品中AFB,多，则被抗体结合酶标 AFB,抗原少，颜色浅，反之则深。用目测法或仪器法与AFB，标样比较来判断样品中AFB,的含量。 4 试荆和材料 4.1AFB,酶联免疫测试盒组成 4.1.1 包被抗体的聚苯乙烯微量反应板:24孔或48孔。 4.1.2A试剂:稀释液，甲醉:蒸馏水为7:93(V/V). 4.1.3B试剂:AFB，标准物质(Sigma公司，纯度1000)溶液，1.00pg/Lo 4.1.4 C试剂:酶标AFB，抗原(AFB,辣根过氧化物酶交联物，AFB,-HRP),AFB,:HRP摩尔比) 2:1, 4.1.5D试剂:酶标AFB，抗原稀释液，含0.1%牛血清白蛋白((BSA)的pH7.5磷酸盐缓冲液(PBS), pH7.5磷酸盐缓冲液的配制:称取3.01g磷酸氢二钠(Na,HPO,1214i0),0.25g磷酸二氢钠 (NaH,PO,·2H,O),8.76g氯化钠(NaCI)加水溶解至1L, 4.1.6E试剂:洗涤母液，含0.05%吐温-20的PBS溶液。 4.1.7F试剂:底物液a，四甲基联苯胺(TMB)，用pH5.0乙酸钠一柠檬酸缓冲液配成浓度为。.2-g/L pH5.0乙酸钠一柠檬酸缓冲液配制:称取15.09g乙酸钠(CH,COONa·3H,0),1.56g柠檬酸(C,H,O, ·H2O)加水溶解至11 4.1.8G试剂:底物液b,ImLpH5.0乙酸钠一柠檬酸缓冲液中加人。3%过氧化氢溶液281,1。 4.1.9 H试剂:终止液，c(H2S0,)二2mol/L硫酸溶液。 国家质1t技术监督局1998一08一28批准 199，一01一01实施 GB/T 17480-1998 4.1.10 1试剂:AFB、标准物质(Sigma公司，纯度100%)溶液，50.00pg/1 4.2 测试盒中试剂的配制 4.2门 C试剂中加入1.5mLD试剂，溶解，混匀，配成试验用