细胞总蛋白提取-考马斯亮蓝测蛋白含量6.docxVIP

蛋白样品的获得主要包括破碎法、沉淀法、蛋白溶解等，可以根据实验目前选择最合适的方法，本文主要总结了蛋白抽提的仪器和材料的准备，试剂溶液的配制以及具体的操作步骤。蛋白提取方法1 材料和方法1.1 材料1.1.1 组织和细胞的来源：1.1.2 仪器设备机械组织匀浆器低温高速离心机 (>40,000 g)超速离心机超生细胞破碎仪超纯水装置1.1.3 试剂三氯醋酸 (TCA)丙酮二硫苏糖醇 (DTT)尿素CHAPSPMSFEDTA乙醇磷酸考马斯亮蓝R350抑肽素A亮肽素试剂纯度均应是分析纯或以上。1.1.4 溶液配制(1) PBS：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L;(2) EDTA 储存液：18.61 g Na2EDTA?2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用;(3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml，100×)10 mg/ml溶于水，-75℃保存;使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存;(4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml，100×)1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存;使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存;(5) PMSF储存液 (10 mM, 100×):17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃ 保存。DTT 储存液 (1 M):0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。(7) 裂解液:Lysis buffer A(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer C40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Lysis buffer E(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer F100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。蛋白酶抑制剂混合物[3]成分 终浓度蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mMEDTA 0.3 mg/ml (1 mM)抑肽素 0.7 μg/ml亮肽素 0.5 μg/ml1.2 方法1.1.1组织蛋白提取方法1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1](1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步;(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织;(3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸(w/v)的丙酮溶液中;(4)蛋白–20℃沉淀过夜;(5)35000×g(6℃)离心30min;将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中;(7)-20℃放置1h;35000×g(6℃)离心30min;(9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀;(10)在裂解液中重新溶解沉淀(50-100mg组织需要1ml裂解液);(11)15℃,40000×g，离心1hr;(12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。1.2.1.2超速离心法(1)取材;(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s;(3)组织悬液15℃，10000×g离心10min;(4)上清液4℃，150000×g超速离心45min;(5)小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min;取离心上清。Bradford法定量，分装后置–75℃保存。1.2.2培养细胞蛋白提取1.2.2.1循环冻融法(1)吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次;(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中