农吉利碱脂质体中药物含量及包封率测定方法研究.docVIP

农吉利碱脂质体中药物含量及包封率测定方法研究 　　[摘要] 该文建立了HPLC测定农吉利碱脂质体中药物含量的方法，农吉利碱在1.6～102.4 mg·L-1线性关系良好（r=0.999 8），日内精密度、日间精密度、稳定性、重复性的RSD分别为0.61%，0.92%，1.7%，1.6%，农吉利碱的回收率为（99.96±0.50）%，表明HPLC可以准确测定农吉利碱脂质体中药物；同时建立了微柱离心法测定农吉利碱脂质体中药物包封率，游离药物的柱回收率为（94.44±0.77）%，空白脂质体柱回收率为（95.86±0.68）%，平行测定3份农吉利碱脂质体的包封率，其RSD为4.0%，说明微柱离心法测定农吉利碱脂质体包封率方法准确可行。 　　[关键词] 农吉利碱；HPLC；包封率；微柱离心法 　　农吉利碱又称农吉利甲素、野百合碱、猪屎豆碱、大叶猪屎豆碱等，对多种肿瘤有抑制作用[1]，临床用于治疗皮肤癌如鳞状细胞癌（SCC）和基底细胞癌（BCC）等，1977年版《中国药典》收载了农吉利药材及盐酸农吉利碱注射液[2]。 　　农吉利碱属于吡咯里西啶类生物碱（PA），目前PA是已知的最重要的植物性肝毒成分之一，被称为肝毒吡咯里西啶生物碱，若被吸收进入体循环具有非常明显的毒性。除可引起血小板、白细胞减少和胃肠道反应、泌尿系统刺激等症状外，最明显的毒性是肝脏毒性，它对肝脏具有蓄积的、不可逆的、强烈的毒性作用，可引起肝细胞出血性坏死、肝巨细胞症及静脉闭塞症等[3]。其肝功能损害与用药剂量有关，超过1 000 mg以上，即可出现肝大、腹水、黄疸等。显然，农吉利碱注射给药副作用太大，因此1977年之后出版的《中国药典》对农吉利药材及注射剂未予继续收载。事实上，农吉利碱原形化合物毒性较弱，而是在经过肝脏转化成代谢产物后引起肝毒性[4]。因此，在民间或医院中常采用农吉利鲜草浆或干品粉末外敷用于治疗SCC和BCC，毒性小且效果良好[5]，但是临床应用不便。 　　因此，根据皮肤癌的特定需要与农吉利碱性质，考虑将其制备成定位于皮肤局部的外用脂质体制剂，以达到高效低毒、使用方便的目的。近年来，国内外已有采用脂质体作为局部给药载体用于皮肤癌药物实验和临床研究的报道[6-7]，但尚未见有关农吉利碱局部用脂质体治疗皮肤癌的研究。 　　脂质体制备过程中，含量和包封率是非常关键的评价指标。为了有效地控制农吉利碱脂质体的制备过程和质量，作者采用HPLC建立了定量分析农吉利碱脂质体中药物含量的方法，并建立了微柱离心法测定农吉利碱脂质体的包封率，为农吉利碱脂质体制剂的进一步开发奠定了基础。 　　1 材料 　　制备型高效液相色谱仪系统（德国LUMTECH）；LUMTECH化学工作站（K501泵，K2501紫外检测器）；JA1003电子天平（上海精科有限公司）；UV759S紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）；YXJ-2型高速离心机（常州金檀电讯电器厂）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。 　　农吉利碱原料药（南京泽朗医药科技有限公司，纯度≥98%）；大豆卵磷脂（S80，上海太伟药业有限公司）；胆固醇（国药集团化学试剂有限公司）；葡聚糖凝胶（Sephadex G-50，瑞典Pharmacia公司进口分装）；其他试剂均为分析纯。 　　2 方法与结果 　　2.1 脂质体的制备 　　2.1.1 空白脂质体的制备 称取磷脂200 mg，胆固醇40 mg，共同溶于无水乙醇10 mL中，置于50 ℃水浴中减压蒸发成膜，加入蒸馏水15 mL，50 ℃条件下充分水化，探头超声，0.22 μm微孔滤膜过滤后即得空白脂质体。 　　2.1.2 农吉利碱脂质体的制备 称取磷脂200 mg，胆固醇40 mg，共同溶于无水乙醇10 mL中，置于50 ℃水浴中减压蒸发成膜，加入含有农吉利碱的溶液15 mL，50 ℃充分水化，探头超声，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得农吉利碱脂质体。 　　2.2 脂质体中农吉利碱含量测定方法 　　2.2.1 色谱条件 Ultimate TM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.5%三乙胺溶液（pH 7.0） （30∶70）；检测波长216 nm；柱温室温；流速0.8 mL·min1；进样量20 μL。 　　2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取农吉利碱8.0 mg，置于50 mL量瓶中，加入少量流动相溶解，并定容至刻度，摇匀，作为母液备用。取一定母液加流动相稀释成质量浓度为25.6 mg·L-1的溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液即得。 　　2.2.3 供试品溶液的制备 精密移取农吉利碱脂质体