药物遗传毒性和致癌性研究现状和动向解读课件.ppt

主要内容 遗传毒性评价的指导原则 SFDA ICH FDA-Redbook FDA-CDER FDA-CDER EMEA EMEA EMEA ICH S2A+S2B=S2(R1) ICH S2A+S2B=S2(R1) 整合试验的最高剂量和暴露 ICH S2(R1)修订小结 主要内容 遗传毒性传统试验方法 Ames试验 测试系统：细菌 鼠伤寒沙门氏菌：组氨酸营养缺陷型 埃希氏大肠杆菌：色氨酸营养缺陷型 菌株特性鉴定 Ames试验 浓度设置 阴性对照组/溶剂对照组； 受试物至少五个剂量组； 阳性对照组； 方法 平板掺入法： - 0.1 mL受试菌液； - 0.1 mL受试物、溶剂对照或阳性物溶液； - 0.5 mL磷酸钠缓冲液/S9混合液； - 2.0 mL融溶的顶层琼脂 （0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5 mM生物素 和0.05mML－组胺酸 ） 混合后，铺于底层琼脂上，室温凝固。 预培养法 - 将下列物质在冰浴上混合： 0.5 mL S9混合液或0.5 mL磷酸缓冲液 0.1mL过夜培养菌液（大约10^8菌量） 0.01 mL受试物溶液（或对照，溶剂和阳性对照物溶液） - 将该混合液在37℃下培养20分钟（水浴中） - 然后加入2mL含有0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5 mM生物素和0.05mM L－ 组胺酸的融溶顶层培养基，铺至基础培养琼脂表面（V-B培养基E），在 室温下凝固。 代谢活化系统 大鼠肝S9混合液 S9制备方法：取5只雄性大鼠，处死大鼠的前5天单次腹腔注射给予500 mg/kg的Aroclor 1254。处死，放血，无菌取肝组织，匀浆，经9000g离心10分钟后的上清液部分为S9。将S9分装成2-4mL/管，冷冻保存在-70℃～-85℃。 结果观察和判定 计数突变菌落数－致突变性 观察背景菌斑－毒性 判断是否具有致突变性 测试系统 哺乳动物细胞：CHL, CHO 人外周血淋巴细胞 细胞核型 剂量设置 阴性对照组/溶剂对照组； 受试物至少三个剂量组； 阳性对照组； 方法 细胞复苏、培养； 受试物处理； 加入秋水仙素，使细胞停止于分裂中期； 收获细胞，滴片 空气干燥，染色 处理条件 包括代谢活化和非代谢活化条件 在处理后6和24小时收获细胞 代谢活化条件下，受试物处理时间为3小时 读片分析 有丝分裂指数－毒性 染色体结构畸变 染色体数目畸变 遗传毒性传统试验方法 试验系统 小鼠淋巴瘤L5178Y TK+/-细胞 既能够检测点突变，也能够检测出大的染色体损伤 自发突变率高，需要定期清除自发突变。 小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA） 培养基 不含马血清的RPMI1640培养基 含10%马血清的RPMI1640培养基 含20%马血清的RPMI1640培养基 受试物处理时间 TK基因突变试验中，要使用短时处理(3～4小时)方式。但张立实和Honma等的研究表明，使用长时间(24或48小时)处理可显著提高MLA对某些染色体断裂剂和纺锤体毒物的检出率。 突变选择剂 在MLA中最初使用5-溴脱氧尿苷（BUdR）作为突变选择剂，后来改用三氟胸苷（TFT）。二者均为胸苷类似物，都能被胸苷激酶磷酸化，其磷酸化产物掺入DNA 可导致 tk+/- 细胞死亡。但TFT的作用比BUdR更迅速， TFT在一个细胞世代即可阻滞 tk+/- 细胞，因此TFT选择平板背景清晰；而BUdR则需要经历数个细胞世代才能完全阻滞 tk+/- 细胞，故可产生分散的微小集落（microcolony），形成特征性的背景阴影（background haze）。因此，现TFT已基本取代了BUdR，成为TK基因突变试验的常规选择剂。 基本方法 软琼脂平皿法（soft agar method）在美国使用较多。在平皿中生长的抗性突变细胞集落呈近似正态分布，根据实验结果可计算克隆效率（cloning efficiency，CE）和突变率（mutation frequency，MF）等指标。 微孔平板（microwell method） （即96孔培养板）法在欧洲使用较多。在微孔中生长的抗性突变细胞集落呈Poisson分布，根据实验结果可计算接种效率（plating efficiency，PE）和突变率等指标。 突变集落 在TK基因突变试验中，经过TFT选择后长出的抗性细胞集落（即 tk-/-突变体）可分为两种类型，即大集落（λ集落）和小集落（σ集落）。 微孔平板法：大集落≥微孔直径的1/4 小集落＜微孔直