猪支原体肺炎诊断方法的研究进展.doc

猪支原体肺炎诊断方法研究进展 ????? 猪肺炎支原体(Myeoplasma hyopneumoniae，Mhp)是一种无细胞壁、介于细菌和病毒之间的最简单的能够自行复制的原核生物。Mhp是与猪的下呼吸道纤毛上皮细胞紧密结合的细胞外病原体，而不是通过组织侵入体内。体内感染时，Mhp识别呼吸道黏膜纤毛细胞的特异性受体，并在呼吸道繁殖。一般认为，Mhp与呼吸道黏膜纤毛的特异性黏附是引起支原体肺炎的先决条件。所以，长期以来人们一直在努力试图揭示这种黏附作用的机理。另外由于肺炎支原体能穿透黏膜层与纤毛粘在一起，破坏纤毛的完整性，同时分泌一些有害因子，破坏纤毛的游走性，致使纤毛大量脱落，这为其它细菌和病毒入侵创造了条件，使损失加剧。猪单独感染猪肺炎支原体，猪体重和饲料转化率没有降低，也不影响体内脂肪和蛋白质的增加。短期对猪的生长无明显影响。然而当猪肺炎支原体与其它病原体共同感染时，猪的临床症状加重。 ? ????? 1临床诊断 ????? 猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine，MPS)主要临床症状是猪感染后发生慢性干咳、生长受阻、发育迟缓、发病率高、死亡率低以及扩散缓慢，易反复发作。但猪肺炎支原体易与其它病原体如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、肺炎巴氏杆菌等混合感染，造成MPS临床症状复杂化，而且有些感染猪并不出现临床症状，因此，通过临床症状只能怀疑猪息有MPS。 ? ????? 2病理学诊断 ????? 进行病理剖检时，发现病变主要在肺脏、肺门淋巴结和纵膈淋巴结，其他组织器官没有特殊病变。特征病变为肺脏膨大，有不同程度的气肿和水肿，双肺的心叶、尖叶、中间叶和部分病例的膈叶前下缘出现对称性融合性支气管肺炎病变，其中以心叶最明显，尖叶和中间叶次之。 ? ????? 3病原检测技术 ????? 3．1病原分离培养 ????? 能从患病部位分离出肺炎支原体是确诊猪患有MPS的一种特异的方法。但Mhp是最难分离和鉴定的病原体之一，它生长缓慢且经常因猪鼻支原体过度生长而被掩盖，而且药物治疗后或康复的猪也很难再分离出Mhp。虽然通过改进分离用培养基和分离方法从病变部位分离出Mhp的分离率逐渐增高，但在多数情况下，分离培养诊断仍不可行。 ????? 3．2免疫荧光技术 ????? 1970年L·Eluger等首先报道用荧光技术来检测猪肺中的Mhp，1971年Earlier将Mhp接种到兔肉汤后用直接免疫荧光法进行诊断。随后改良的直接和间接荧光抗体技术也被用于检测肺组织中的Mhp。Amanfu等用改良的直接荧光抗体技术连续检测人工感染猪，结果接种后2～12周在患病猪的细支气管和细支气管上皮检测到Mhp，接种后4～6周荧光最强，8～12周荧光强度逐渐下降。而将间接免疫荧光技术用于冰冻切片的检测，已在丹麦SPF猪群中得到了应用。荧光抗体技术特别适合于Mhp急性期感染，因为这时在肺部存在大量的病原。但当猪在受到抗生素治疗后或转为慢性感染时，血清阳性猪由于支原体的数量不足，用免疫荧光技术检测而易出现假阴性结果。 ???? 3．3免疫酶技术 ????? 酶联免疫过氧化物和间接免疫过氧化物酶试验用于检测病肺中的Mhp，克服了荧光抗体技术不能有效检测慢性感染猪、需要新鲜冰冻组织和荧光显微镜以及样品不能长期保存的缺点。用ELIP检查肺冰冻切片和支气管的涂片时，支原体被染成淡红褐色的多形态颗粒，反应很稳定。Doster等用福尔马林固定石蜡包埋猪肺，用间接过氧化物酶试验检测Mhp，用光学显微镜就能观察到结构清晰的Mhp，而且样品可长期保存，用于重新评价，比荧光抗体法更敏感。当没有鲜组织或其他特异性试验时可采用此法。 ????? 3．4免疫印迹法 ???? 免疫印迹(immtmoblot)是以免疫覆盖液为检测探针，对抗原或抗体进行印迹分析的通称。蛋白质印迹中由于引进了血清学检测技术，使结果的分析更加准确、细致。StPkiovstiL(1991)在蛋白质印迹试验中用抗猪肺炎支原体P36蛋白的兔血清检测了13株不同地方的猪肺炎支原体和来自不同实验室的3株标准菌株J，实验结果显示每株菌在36KDa蛋白处有很强的反应。用同样的抗血清，而抗原用47种来自人、老鼠、兔子、家禽、反刍动物、狗和猫的支原体属作蛋白质，实验结果显示这些微生物与P36抗血清无反应。 ????? 3．5核酸探针诊断技术 ????? 核酸探针技术可解决猪肺炎支原体培养和鉴定难、费时的难题。Stemke将MhpDNA的EcoR l酶切片段随机克隆到Ml3mpl9中，用重组产物作探针来检测Mhp。此方法敏感性高，但特异性不强，易与同源性高的絮状支原体产生交叉反应。Ahrens等将Mhp基因文库中的一个l．3 kb的DNA片段用35S标记作为探针通过点杂交检测猪、牛的不同