实验十 病毒的分离 禽类实验室诊断技术课件.ppt

病毒的分离 样品的采集与保存 样品的处理 病毒的鸡胚接种 一、样品的采集与保存 1.样品采集 机体尚未产生抗体之前的疾病急性期样品，尽可能新鲜，不同病毒病采集材料不同。 新城疫病毒 ---呼吸道分泌物、脑、脾 禽流感病毒 ---器官分泌物、泄殖腔内容物 马立克病毒---肿瘤组织、白细胞 传染性囊病病毒—法氏囊、脾 传染性喉气管炎病毒—气管分泌物、气管、肺 传染性支气管炎病毒---气管分泌物、肺、输卵管、肾 禽痘病毒---痘斑 脑脊髓炎病毒---脑脊髓 小鹅瘟病毒—肝、脾、肾 鸭瘟病毒—肝、脾、肾、血液 禽白血病病毒—全血、血浆 鸡病毒性关节炎病毒—滑液 网状内皮组织增生病病毒---脾、全血、肿瘤组织 2. 样品的保存 多数病毒对热不稳定，应立即接种为好。如需保存或运送，最后在冷条件下，48h送至实验室。一般置50%中型甘油中，4℃保存。如需保存时间较长，-20 ℃以下保存。 二、样品的处理 处理目的：除菌、将组织样品中病毒释放出来。 1. 除菌 （1）采集样品尽可能无菌操作 （2）加抗菌药物 青霉素、链霉素1000IU/ml （3） 0.22-0.45微米滤膜过滤。 2.研磨和稀释 研钵研磨，稀释液通常用生理盐水或Hanks液，制成10%-20%组织悬液。有的也可反复冻融（如法氏囊病毒），再以2000r/min离心10-20min，吸取上清液供接种。 三、病毒的鸡胚接种 实验室培养病毒常使用动物接种和鸡胚培养两种方法，而鸡胚培养更为常见。一般而言，禽病毒病大部分可经鸡胚分离病毒，其他动物病如犬瘟热也可经鸡胚分离病毒。 应用于（1）禽痘病毒、传染性喉气管炎病毒及传染性法氏囊病毒的分离、鉴定和疫苗制备；（2）禽流感病毒、新城疫病毒及传染性支气管炎病毒的分离、诊断抗原和疫苗的制备。 不同病毒接种途径不一样。 （一）实验目的 1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方法。 2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病毒的操作技术。 （二）实验器材 1.鸡胚： 要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。孵化前的鸡胚应注意消毒，置37-38℃、相对湿度45-60%的孵卵器中孵育，每日翻蛋数次，孵蛋第4天开始照蛋，弃去无精蛋和死胚。不同接种途径选择不同日龄的活胚接种。 2.接种材料： 本实验采用新城疫弱毒活疫苗作试验用。 3.各种器材： 孵蛋器、照蛋器、蛋托、打孔器（锥子 ）、1ml注射器、41/2针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、记号笔、固体石蜡、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管、灭菌平皿、试管、酒精灯 。 （三）实验方法 1.接种前的准备 （1）鸡胚准备 接种前用照蛋器观察是否为受精卵及其活力。发育正常鸡胚，可见清晰的血管及活动的鸡胚。未受精和死胚胚体固定在一端不动，看不到血管或血管消散，应剔除。 鸡胚的日龄根据接种途径和接种材料而定。 　（1）卵黄囊接种，选用6～8日龄的鸡胚； （2）绒毛尿囊腔接种，用9～11? 龄鸡胚； （3）绒毛尿囊膜接种，用11～13日龄的鸡胚。 （4）羊膜腔接种，用10-12胚龄的鸡胚。 （2）病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各100-5000IU，置室温中1h处理。 2.接种 鸡胚接种的方法有几种： 尿囊腔接种 主要用于禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的分离、增殖、传代。 （1）在照蛋器下，用铅笔勾出气室及胚胎的位置，并在尿囊膜血管较少的地方作记号。 （2）消毒：用碘酒消毒气室蛋壳，酒精脱碘，气室向上竖放于蛋托上，用灭菌钢针或锥子在记号处打一孔。 （3）接种病毒：用9＃针头1ml注射器吸取鸡新城疫病毒，针头通过打出的孔进针向鸡胚方向刺入0.5-1cm ，注入0.1～0.2ml。 （4）用融化的石蜡封闭小孔，39℃孵化器中孵化72h。 （5）收获 新城疫病毒在接种后48-72h即可收获，此时鸡胚多死亡。收获前应将鸡胚置4℃冰箱中冷却4-24h，使鸡胚血管收缩，以免解剖时出血。收获时将胚蛋气室向上直立，用碘酊将气室端进行消毒，击破气室端蛋壳用无菌镊子除去气室卵壳及卵膜，暴露绒毛尿囊膜，用吸管经无血管处刺入尿囊腔、吸取尿囊液，每一鸡胚平均可得尿囊液5-6ml，作4倍稀释后，贮人无菌小瓶，并作无菌试验，冻冻保存，作毒种或试验之用。 最适于分离和增殖斑点状或痘疱状病灶为特征的病毒，如禽痘病毒、传染性喉气管炎病毒等，传染性法氏囊病毒和鸭瘟病毒也用此法接种。 取11-13日龄的鸡胚，照蛋划出气室、胎位。 在靠近气室端无大血管处做开窗标记，对标记处及周围消毒；将标记处击破蛋壳，小心除