动物细胞培养理论教授II.PPT

动物细胞培养实验理论讲授(II) 指导教师：费晓方 2014年6月 传代细胞培养实验 ---贴壁细胞HeLa细胞传代培养 实验目的和要求： 掌握无菌操作技术。 掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。 掌握贴壁细胞传代过程中的消化分散技术。 熟练细胞计数方法。 了解培养液配制方法。 熟练倒置显微镜的使用。 本次试验应用HeLa细胞或A375-S2细胞进行传代培养。 HeLa 细胞：人子宫颈癌细胞株 A375-S2细胞：人黑色素瘤细胞株 实验材料： 每组的超净台中备有以下物品： 1.材料 50ml RPMI1640培养液1瓶； 5ml小牛血清（FCS) 1瓶； 2ml胰蛋白酶 1瓶； 1ml谷氨酰胺 1瓶； 1ml Hepes 1瓶； PBS(-)1 瓶 实验材料： 每组的超净台中备有以下物品： 2. 器材 灭菌1ml移液管 1支； 装有试管的灭菌小饭盒 1个； 试管架1个； 1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个； 细胞计数板1块； 镊子1把，小烧杯1个； 酒精灯1台； 培养好细胞的细胞培养瓶1个 实验操作步骤： ： 1.超净台灭菌，打开风机，点燃酒精灯，消毒双手准备操作。 2.从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察细胞形态。 3.配置应用培养液（含有10%小牛血清，1%谷氨酰胺，PH7.2-7.4的RPMI1640培养液）待用。 4.倒掉原有的细胞培养液，加入5mlPBS(-)洗涤2次。（注意：每次操作要用酒精灯对培养瓶口进行灼烧，两个容器瓶口不能接触） 5.加入胰蛋白酶100-200μl，迅速前后旋转细胞培养瓶4-5次，以便胰蛋白酶包被所有细胞，于37°C 培养箱中孵育5分钟，消化细胞。 实验操作步骤： 6.在显微镜下观察细胞变化，待细胞渐渐变为球形，尚未从培养瓶壁上脱落下来时，用移液管吹打，使细胞从培养瓶壁上脱落下来（或用手掌左右来回轻敲培养瓶的侧壁，使细胞从瓶底面脱落下来），再加入细胞培养液2-5ml。 7.如果细胞不能吹打下来，再放回培养中孵育几分钟。 8.倒入50ml离心筒中，在向细胞培养瓶中加入10ml培养液洗涤，在一并倒入离心筒中，1000-2500转离心，10分钟。 9.取出离心管，倒掉上清液，在桌面上轻敲离心筒，使沉降在离心筒底的细胞分散均匀。 实验操作步骤： 10.倒入5ml细胞培养液，混匀。细胞计数。 11.取1105个细胞放入细胞培养瓶内，加入5-8ml培养液。 12.显微镜下观察。 13.将传代细胞放入培养箱中培养。 14.两天后显微镜下观察细胞生长情况。 原代培养实验理论讲授 ---小鼠胚胎成纤维细胞原代培养 实验原理： 原代细胞培养 是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。 · 根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。 成纤维细胞：是从成年小鼠身上提取 成纤维细胞。 胚胎成纤维细胞： 是从小鼠胚胎中提 取的成纤维细胞。 胚胎成纤维细胞的活性和繁殖能力 比成纤维细胞更好。 小鼠胚胎成纤维细胞 掌握无菌操作技术。 掌握组织细胞的消化与分散。 熟悉原代细胞培养的一般方法与步骤。 熟悉小鼠解剖操作技术。 实验目的和要求： 动物的选择： 选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，胚胎成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 每组小鼠胚胎2-5个 实验材料： 每组的超净台中有以下物品： 1. 50ml 配制好的RPMI1640（或DMEM）培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)(生理型磷酸盐缓冲液)1 瓶 2. 100ml灭菌烧杯2个； 3、50ml离心筒2个 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个 4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个 5、细胞计数板1块； 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把； 7、酒精灯1台； 试验操作步骤： 1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠) a．采用认可的方案处死啮齿动物。