保护酶基因耐盐植物的总DNA转基因耐盐植物研究现状.PPT

海藻细胞培养 单细胞分离和培养 细胞悬浮培养 原生质体分离和培养 单细胞分离 机械法 最早采用 多以大型海藻的叶状体为材料 酶解法 应用广泛 适用于海藻的细胞和原生质体分离 培养物分离法 各种单细胞分离方法比较 机械法 细胞不受酶影响，无需质壁分离处理 产率低，不适用于排列紧密的海藻叶状体 酶解法 操作简单，产率高，应用广泛 培养物分离法 处理温和，产率较高，周期较长 常用于藻体细胞的分离 单细胞固体培养法 平板培养法(plante culture) 单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。 看护培养法(nurse culture) 用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 饲养层培养法(Feeder layer culture) 体外细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。 细胞悬浮培养 体细胞悬浮培养 分离获得海藻单细胞，根据不同目的筛选单细胞，挑选生长速度快的生长株续代培养 生殖细胞悬浮培养 采集大型褐藻释放的游孢子，经无菌处理后，细胞悬浮培养获得雌雄配子体，在适宜条件下，培养物可维持在配子体阶段并不断分裂增殖，扩大配子体的数量形成藻体培养的无性繁殖系 原生质体融合技术 将两种不同植物的体细胞用酶解法除去细胞壁，分离成裸露的原生质体，使两种原生质体融合成杂种细胞； 利用细胞的全能性在培养基上重新增生细胞壁，并进行细胞的分裂、分化与生长发育； 经诱导形成杂种株，从中选优去劣，按育种目标要求培育出新品种，并创造出新物种。 植物原生质体细胞杂交流程 原生质体制备 原生质体融合 杂交细胞选择 杂交细胞培养 杂交细胞再生植株 杂交体植株鉴定 藻体原生质体分离技术 取海藻近顶端叶状体，洗涤并作无菌化处理 叶片切细后，置于酶溶液中孵育处理； 离心分离，弃去酶液，沉淀置于微高渗海水中洗涤数次； 彻底洗尽酶液后，将原生质体悬浮于含有适量渗压剂的培养液中培养，并计数 原生质体的净化 过滤 离心清洗 梯度离心 海藻原生质体分离影响因素 酶 种类 纯度和浓度 作用温度 PH 藻体材料 渗压剂 阳离子 等 分离海藻原生质体的酶类 纤维素酶 果胶酶 以海藻为食的海洋生物消化系统中获得的酶 分解海藻的细菌中获得的酶 问题（难点）？ 海藻细胞壁组成 酶的标准化 原生质体培养技术 悬浮培养 有利于某些种类原生质体的分裂； 培养一段时间后，可有效降低培养基渗透压； 利于培养基的更换，减少代谢产物的影响； 易于降低细胞密度 平板培养 易于观察 原生质体培养影响因素 培养基营养 渗压剂 植板密度 光照 温度 原生质体细胞融合方法 NaNO3处理 异核形成率低 高PH-高钙离子处理 高PH可能对某些海藻的原生质体有毒害作用 处理温度不宜过高，时间不宜过长 聚乙二醇（PEG）处理 异核形成率高，可重复性强 融合无特异性 双核异核细胞比例大 电融合法 方便快捷，成功率高 对细胞伤害小，异核细胞稳定 双核异核细胞比例大 原生质体融合技术影响因素 处理前细胞状态控制； 原生质体化程度； 原生质体纯化方法及纯度； 融合过程中细胞状态控制 外界条件：温度、光照、盐度、PH值和处理时间； 渗压剂种类和浓度； 原生质体膜的稳定性； 影响原生质体化 原生质体细胞的因素 海藻杂交细胞的选择 显微分离：在显微镜下凭借细胞形态或颜色差异，筛选杂交细胞。 借鉴高等植物杂交细胞选择系统： 互补分析（双荧光标记法） 杂交细胞鉴定 表观鉴定 核型分析 同功酶分析 1,5-二磷酸核酮羧化/加氧酶亚基多肽图谱分析 叶绿素DNA限制性酶切分析 小结：海藻体外培养技术难点 体外培养： 海藻生长调节物质的分离和鉴定 细胞分离与原生质体技术 海藻细胞壁结构与成分的阐明 合适的细胞壁消化酶 海藻组织培养现状与展望 起步晚 人员少 加强交流 开展经济海藻的离体快速繁殖研究 利用组织培养生产活性物质 海藻中的活性成分 蛋白质 多糖 食物纤维 维生素 无机元素 不饱和脂肪酸 summary 大型海藻生物技术 海藻基因工程 海藻基因工程的特殊性 海藻基因工程的研究重点 组织培养技术 技术基础 海藻组织培养技术 海藻原生质体融合技术 * * * * * 常用概念 植物组织培养（Plant Tissue Culture） 通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体），接种到培养基上，在人工控制的条件下培养，使其产生完整植株的过程。 外植体（explant ） 能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段。 愈伤组织（Callus） 人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 基本概念 在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在