高中生物奥林匹克竞赛辅导专题讲座 专题九 DNA技术和人类基因组.docVIP

高中生物奥林匹克竞赛辅导专题讲座 专题九 DNA技术与人类基因组 【竞赛要求】 DNA操作的工具 质粒是基因的载体 内切酶与连接酶 基因克隆 反转录 DNA探针 PCR技术 人类基因组 DNA技术的应用 10．DNA技术带来的危害与伦理问题 【知识梳理】 一、基因工程概述 基因工程：是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中安家落户，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 这个定义表明，基因工程具有以下几个重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品拷贝出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。基因载体或称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段DNA聚合酶：合成双链cDNA中第二条链 缺口平移制做探针 DNA序列分析 填补3′末端 Taq酶 催化PCR反应，聚合DNA 反转录酶 a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针 碱性磷酸酶 切除DNA5′末端磷酸基 末端转移酶 在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾 DNA酶切割DNA RNA酶切割RNA 在所工具酶中，限制性核内切酶具有特别重要的意义。所谓限制性核酸内切酶就是识别 DNA的特异序列，并在识别点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。根据酶的组成，所需因子及裂解DNA方式的不同，可将限制性核酸内切酶分为三类。重组DNA技术中常用的限制性核酸内切酶为类酶，大部分类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。 　　下面小结限制性内切酶 　　类 　　需 Mg 2+、SAM及ATP 　　识别位点复杂，特异性差，切割位点距识别点远。 　　类 　　仅需 Mg 2+ 　　识别切割特异性强，切割发生在识别位点。 　　类 　　需 Mg 2+及ATP 　　切割位点在识别位点周围，酶活性不单一。 DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶，该酶以RNA为核板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序(其中V与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶。后来发现反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。 　　反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNA桪NA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程()。 　　携带反转录酶的病毒又称为反转录病毒，它侵入宿主细胞后先以病毒RNA为模板靠反转录酶催化合成DNA，随后这种DNA环化并整合到宿主细胞的染色体DNA中去，以原病毒的形式在宿主细胞中一代代传递下去。以后又发现许多反转录病毒基因组中都含有癌基因，如果由于某种因素激活了癌基因就可使宿主细胞转化为癌细胞。 　　大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需