生物药物分析与检验电分析法讲解.ppt

* * * * * 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * 由于醋酸纤维薄膜的亲水性比纸小，它所容纳的缓冲液也较少，电泳时电流的大部分是由样品传导的，故分离速度快、电泳时间短。 醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰。 由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短， 血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。 某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板， 　　 * 聚丙烯酰胺凝胶不仅起着支持分离样品和抗对流的作用，它还能主动参与样品的分离过程。 * 根据SDS电泳的原理，样品缓冲液中必须含有3—4倍于蛋白质的SDS和足以断裂二硫键的还原试剂(2%二硫苏糖醇或5%b-巯基乙醇)。配制好的样品还必须在100℃水浴中煮沸3—5分钟(对一些样品可在37℃保温6小时)。 选择合适分子量范围的市售蛋白标准或自己配置—套蛋白(5～7种蛋白)溶解在样品缓冲液中，与样品一样在100℃煮3～5分钟，分装，在-20℃可保存六个月。但使用前还需再煮和加巯基乙醇(如果样品缓冲液中是用琉基乙醇作还原剂) 一般为考马斯亮兰染色和银染色 。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * HPLC流动相的流形为抛物线形的层流，在管壁处的速度为零，管中心的速度是平均速度的2倍，引起的谱峰展宽较大。 电渗流呈平流，引起的谱峰展宽很小，是毛细管电泳能获得较HPLC更高分离效率的重要原因。 4. 电渗流的作用 电渗流通常流向负极，电渗流速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍。所以，各种电性物质在毛细管中的迁移速度为两种速度的矢量和，称为表观电泳速度，用vap表示。 * * 当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管。出峰次序是： 阳离子中性分子阴离子 中性分子与电渗流速度相同，不能互相分离。 v=μE=(μ电渗流±μep)E * ν+ =ν电渗流 + ν+ep 阳离子运动方向与电渗流一致； ν- =ν电渗流 - ν-ep 阴离子运动方向与电渗流相反； ν0 =ν电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致； ①电渗流具有像HPLC中泵一样的作用，推动离子前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性离子的分离。 ②改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率和选择性。这是HPCE中优化分离的重要因素。 电渗流在HPCE 的分离中起着极其重要的作用： ③电渗流的微小变化影响分离结果的重现性（迁移时间和峰面积） 。 电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制电渗流的恒定。 * 三、HPCE中影响电渗流的因素 1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。 2.毛细管材料的影响 酸度影响毛细管的表面Si-OH基的电离，特别是在pH4～7范围内，影响更显著，此时溶液pH值与EOF成近线性关系 * 3. 电解质溶液性质的影响 （1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大； pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。 （2）缓冲液阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。 * 缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液粘度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液浓度增加，离子强度增加，电渗流下降。 （3）缓冲液浓度（离子强度）的影响 * * 4. 温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的粘度下降，电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热” 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背