生物药物析与检验 电泳分析法.ppt

当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管。出峰次序是： 阳离子中性分子阴离子 中性分子与电渗流速度相同，不能互相分离。 v=μE=(μ电渗流±μep)E * ν+ =ν电渗流 + ν+ep 阳离子运动方向与电渗流一致； ν- =ν电渗流 - ν-ep 阴离子运动方向与电渗流相反； ν0 =ν电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致； ①电渗流具有像HPLC中泵一样的作用，推动离子前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性离子的分离。 ②改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率和选择性。这是HPCE中优化分离的重要因素。 电渗流在HPCE 的分离中起着极其重要的作用： ③电渗流的微小变化影响分离结果的重现性（迁移时间和峰面积） 。 电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制电渗流的恒定。 * 三、HPCE中影响电渗流的因素 1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。 2.毛细管材料的影响 酸度影响毛细管的表面Si-OH基的电离，特别是在pH4～7范围内，影响更显著，此时溶液pH值与EOF成近线性关系 * 3. 电解质溶液性质的影响 （1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大； pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。 （2）缓冲液阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。 * 缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液粘度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液浓度增加，离子强度增加，电渗流下降。 （3）缓冲液浓度（离子强度）的影响 * * 4. 温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的粘度下降，电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热” 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。 温度每变化1度，将引起背景电解质溶液粘度变化2%～3%； * 5. 添加剂的影响 （1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，电渗流减小。 （2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向 某些阳离子表面活性剂使电渗流减小，某些阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，电渗流增大 （3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使溶液的粘度减小，电渗流增大。 * 第三节 毛细管电泳仪 毛细管电泳仪结构比高效液相色谱仪 简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器等。前三个部件均易实现, 困难之处在于检测器。 * * HPCE仪器流程与主要部件 process and main assembly 电压：0～30kV； 分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：10-19～10-21 mol/L） * 1.高压电源 （1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换； 2. 毛细管柱 （1）材料：石英 （2）规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度=1m * 3.缓冲液池 化学惰性，机械稳定性好； 4. 检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化； 类型 检测限/mol 特点 紫外-可见 10-13～10-15 加二极管阵列，光谱信息 荧光 10-15～10-17 灵敏度高，样品需衍生 激光诱导荧光 10-18～10-20 灵敏度极高，样品需衍生 电导 10-18～10-19 离子灵敏，需专用的装置； * 第四节 分离模式及其分离条件的选择 4.1、毛细管区带电泳（CZE） 毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳, 这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满，带电粒子的迁移速度是电泳和电渗流速度的矢量和。 分离原理 阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出。 中性粒子：无电泳现象，随电渗流同行，在阳离子后流出。但不同结构的中性分子无法相互分离。 *