生物药物析与检验电泳分析法要点.ppt

HPLC流动相的流形为抛物线形的层流，在管壁处的速度为零，管中心的速度是平均速度的2倍，引起的谱峰展宽较大。 电渗流呈平流，引起的谱峰展宽很小，是毛细管电泳能获得较HPLC更高分离效率的重要原因。 4. 电渗流的作用 电渗流通常流向负极，电渗流速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍。所以，各种电性物质在毛细管中的迁移速度为两种速度的矢量和，称为表观电泳速度，用vap表示。 * * 当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管。出峰次序是： 阳离子中性分子阴离子 中性分子与电渗流速度相同，不能互相分离。 v=μE=(μ电渗流±μep)E * ν+ =ν电渗流 + ν+ep 阳离子运动方向与电渗流一致； ν- =ν电渗流 - ν-ep 阴离子运动方向与电渗流相反； ν0 =ν电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致； ①电渗流具有像HPLC中泵一样的作用，推动离子前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性离子的分离。 ②改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率和选择性。这是HPCE中优化分离的重要因素。 电渗流在HPCE 的分离中起着极其重要的作用： ③电渗流的微小变化影响分离结果的重现性（迁移时间和峰面积） 。 电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制电渗流的恒定。 * 三、HPCE中影响电渗流的因素 1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。 2.毛细管材料的影响 酸度影响毛细管的表面Si-OH基的电离，特别是在pH4～7范围内，影响更显著，此时溶液pH值与EOF成近线性关系 * （6）定量测定 定量测定的方法有洗脱法和光密度法。 洗脱法是将确定的样品区带剪下，用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。 光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的物质含量。 醋酸纤维薄膜电泳应用范围较广，可用于检测和分析血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸以及其他生物大分子物质。由于醋酸纤维薄膜电泳法快速且简便，目前在医学和临床生物化学等领域已成为一种常规技术。 应用 人血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 ⒈ 原理：以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，人血清蛋白的pI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离。 蛋白质名称 等电点 迁移率 分子量 清蛋白 4.88 5.9×10-5 69000 α1-球蛋白 5.06 5.1×10-5 200000 α2-球蛋白 5.06 4.1×10-5 300000 β-球蛋白 5.12 2.8×10-5 9000～150000 γ-球蛋白 6.85～7.50 1.0×10-5 156000～300000 人血清蛋白质的等电点和迁移率 概念：以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。 (三)琼脂糖凝胶电泳 天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。 琼脂糖（agarose） 琼脂胶（agaropectin） 天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。 琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下： (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 琼脂糖凝胶电泳的缺点： (1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 (2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 (3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 (4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫