肿瘤分子病理诊断基础-2PPT.ppt

* * * * GeneScan analysis of Ig/TCR products. (a) In GeneScan analysis one of the primers is fluorescently labeled. Resulting fluorescently-labeled products are denatured and the single-strandeds molecules are electrically separated in a high resolution polymer matrix and detected by a laser. In the electropherogram fluorescence intensity (Y-axis) is shown as a function of PCR product size (X-axis). (b) In a polyclonal sample with reactive lymphocytes many different PCR products are found, giving rise to a Gaussian shaped distribution. In a monoclonal sample one clear peak is seen, derived from PCR products of identical size. The most common result in a lymphoma is a mixture of a monoclonal and polyclonal pattern. This is seen as a dominant peak on top of a Gaussian curve. * * * * * * * * * * * * * * * * * 多克隆；梅毒 * * * * * * 单克隆；淋巴瘤 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 基因分型和SNP位点检测新方法：LightCycler? 480系统上的高分辨率熔解曲线分析　高分辨率熔解曲线（HRM）和基因扫描简介　 熔解曲线分析作为一种成熟的研究方法，可用以扩增子的特性研究（例如微生物鉴定，检测突变，以及单核苷酸多态位点的检测SNPs）。与经典的熔解曲线分析相比，高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting, HRM）可以从更细致的程度研究双链DNA的热变性过程，从而获取更多的信息量。HRM做为一种创新、均一、PCR扩增反应后进行的分析方法，可应用于对PCR扩增产物中SNP,，基因突变和甲基化等基因变异检测等广泛的研究分析领域。?? 基因扫描（Gene Scanning）是HRM的一个主要的应用，所谓基因扫描是指在测序之前就能发现给定SNP位点上等位基因的变异；或是在不明确等位基因的情况下，鉴定出未知SNP位点的多态位置，部分取代和提高后继测序工作的效率。HRM可以检测到PCR产物中的突变位点的原理是这些突变位点改变了DNA熔解曲线的形状；纯合子和杂合子样本可以通过使用一种饱和型的DNA结合染料轻松的区分开来，并显示出清晰的熔解曲线图谱。而创新的饱和型DNA结合染料即使是在高浓度存在的情况下，也不会干扰和妨碍扩增反应的进行。借助新一代的DNA染料，高端的硬件设备和成熟的分析软件就可以灵敏的检测到分析序列中的突变位点的存在和相应的序列信息。 ?? 凭借LightCycler? 480系统特有的基因扫描软件和配套提供的高分辨率熔解曲线PCR反应即用型体系HRM PCR Master ，罗氏诊断应用科学部率先提供了基于模块式定量PCR仪上的整合式基因扫描方案。 　高分辨率熔解曲线（HRM）在基因扫描方面的应用优势　 与传统的扩增后需借助额外的仪器进行凝胶电泳的非均一性的突变检测（例如，dHPLC）相比，HRM提供了更高特异性和灵敏度的检测，同时允许了更高的样本检测通量，大大降低了成本。 ?? 从理论上来讲由于与潜在多态位点相邻的序列未知，所以使用序列特异性的探针无法对扩增子进行扫描以发现未知的突变。现在，借助HRM的方法，使用高分辨率染料可以对任一的扩增子中的任何位置上的未知突变进行检测，而不需要等位基因特异性的引物和探针。 ?? 同时扩增反应可以实时在线监测以确定分析是基于可比较的相当的样品DNA量（相近的Cp值）。 　LightCycler? 480上的基因扫描工作流程?? 要想利用高分辨率染料进行基因扫描需要具备以下几个条件：?? ? 高浓度饱和型的专用DNA染料，对于同源和异源的DNA双链核酸分子可