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多酚化合物对多肽淀粉样纤维化的抑制作用 　　很多蛋白质或多肽在一定条件下可以形成淀粉样纤维，至少20 多种人类疾病如阿尔茨海默病、帕金森氏病、家族性淀粉样神经病变以及型糖尿病等与此类淀粉样纤维沉积有关[1~4]. 胰岛素是一种由 51 个氨基酸残基组成的多肽，极易形成淀粉样纤维，通常将其作为研究多肽淀粉样纤维化、筛选抗纤维化药物以及纤维细胞毒性分子机制的模型分子[5]. 虽然目前尚无证据表明任何疾病与胰岛素纤维化有关，但在临床应用中，胰岛素在生产、储存过程中以及在注射部位形成的纤维可能对病人产生免疫原性[6]. 　　为抑制蛋白质淀粉样纤维化，溶解或者破坏淀粉样纤维结构被认为是治疗相关疾病的有效途径。多酚化合物，特别是一些天然多酚类物质可以抑制蛋白质的纤维化[7~9],并能够破坏成熟的纤维结构，将其转变为无定形聚集体，降低纤维的细胞毒性作用[10]. 这些多酚的抗多肽纤维化作用被认为既与其多环和多羟基结构有关，也可能与其抗氧化作用或促氧化作用有关[11,12],但具体作用机制尚无定论。 　　本文采用牛胰岛素作为模型分子，探索了几种结构相近的简单多酚化合物对多肽淀粉样纤维化的抑制作用，以期从这些化合物的构效关系来揭示多酚类化合物抗多肽淀粉样纤维化的分子机制。 　　1 试验部分 　　1.1 试剂与仪器 　　牛胰岛素（ 分子量 5733） 、硫黄素（ ThT） 、氯化硝基四氮唑蓝（ Nitroblue NBT） 、酚化合物及对苯醌购自 Sigma-Aldrich 公司； 电泳相关试剂购自 Bio-Rad 公司； 其它试剂均为国产分析纯。LS-55 型荧光分光光度计 （ 美国 Perkin-Elmer 公司） ; JEM-1400 型透射电子显微镜 （ 日本 JEOL公司） . 　　1.2 实验过程 　　1.2.1 胰岛素淀粉样纤维的制备 用 20 mmol / L 盐酸溶液（ pH = 1. 7） 配制 100 μmol / L 牛胰岛素水溶液，加入不同浓度的酚化合物，于 50 水浴中孵育 5 d,按一定的时间间隔取样并在 4 保存备用。 　　1.2.2 ThT 荧光检测 用 10 mmol / L 磷酸盐缓冲液（ pH = 7. 0） 配制 1 mmol / L ThT 溶液，于 4 避光保存备用。 取 10 μL 孵育的胰岛素样品，加至 10 mmol/L Tris-HCl 溶液（ pH=8. 0） 中，再加入 30 μL ThT溶液使其终浓度为 10 μmol/L,振荡 10 s 左右，用荧光分光光度计记录荧光强度（ 激发波长为 440 nm,发射波长为 484 nm） . 　　1.2.3 透射电子显微镜（ TEM） 观察聚集体形态 将制备的胰岛素纤维或者聚集体用二次蒸馏水稀释 5倍，取15 μL滴于镀膜铜网上，静置 10 min 后用滤纸沿边缘吸干，滴加 15 μL 醋酸铀（ 质量分数为 2%）染色 10 min. 用透射电子显微镜观察纤维形态并拍照（ 电压 80 kV） . 　　1.2.4 SDS-凝胶电泳及电转分析 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS） 采用分离胶（ 质量分数为15%） 在 Tricine 缓冲体系（ pH = 8. 2） 中进行，胰岛素加样量为 10 μg,用考马斯亮蓝染色。 采用 GEHealthcare 电转盒将凝胶上的条带转至聚偏氟乙烯（ PVDF） 膜上，在碱性（ pH = 10） 条件下由 NBT 染色。 　　2 结果与讨论 　　实验条件下，胰岛素可在约 4~5 d 形成成熟的淀粉样纤维，纤维的生长过程采用 ThT 荧光法监测。ThT 是一种能够与淀粉样纤维的 β 片层结构特异性结合的荧光探针，当与淀粉样纤维结合时，其在440 nm 波长光激发下产生 484 nm 的特征荧光发射峰。 与大多数蛋白质纤维化过程相似，胰岛素的纤维生长过程也具有成核-聚合的动力学特征[13],即纤维化主要包括成核、生长和成熟 3 个阶段，ThT 荧光曲线表现为 S 型特征[见图 1（ A） ]. 　　由图 1（ A） 可见，各种酚化合物对胰岛素的淀粉样纤维化作用不同。 200 μmol/L 的苯酚和间苯二酚对胰岛素纤维化有一定的促进作用，相应的 ThT 荧光在 1. 5 d 后开始增强，表明其具有较短的成核期； 与之相比，相同浓度的邻苯二酚和对苯二酚则对胰岛素纤维化表现出明显的抑制作用，相应的ThT 荧光在孵育 3 d 后开始略有上升，第 5 d 的荧光强度仅为胰岛素对照样品的 27%和 19%. 由于邻苯二酚和对苯二酚的纤维化抑制作用可能与其氧化产物醌中间体相关，故采用对苯醌同时进行对照分析。 如图 1（ A） 所示，在 200 μmol/L 对苯醌存在下，胰岛素纤维化几乎被完全抑制，整个孵育过程中ThT 荧光