果蝇S细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定_论文.docxVIP

果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定 [摘要]目的：构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒。方法：用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段，经酶切亚克隆至pGL3Basic的真核表达载体中，转染果蝇S2细胞，通过测定荧光素酶和β半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性。结果：构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3Control中增加了万倍。结论：成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3pac。 [关键词]果蝇S2细胞；荧光素酶；启动子；报告基因；转染 在研究基因功能的过程中，不可避免地要研究基因的调控机制，而基因的表达产物复杂且难以对其定量和定性，要在细胞生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更是非常困难。但报告基因分析系统的发现给基因调控与表达的研究带来了新的希望。近年来，报告基因系统的研究取得了快速的发展。报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控，因此，对真核基因调控的了解可以不通过直接测定调控元件调节转录速率的能力，而是把顺式调控元件与报告基因的序列连接起来，在基因转录的过程中测定报告基因转录产物的表达量，从而判断相应的顺式作用元件的调控能力。作为报告基因必须具备以下特点：（1）由原核基因编码的基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物；（2）细胞内其他基因产物不会干扰报告基因产物的检测；（3）报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高、重复性好。该技术的主要优点是灵敏度高、可信性大及检测方便且适合大规模检测，目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件[13]。荧光素酶（LUC）报告基因来源于北美萤火虫，能催化萤火虫的氧化性羧化作用，同时发射出光子，可被光度计捕获定量。LUC的分析具有快速、方便、线性较好等优点，正成为最广泛使用的报告基因。pGL3系列的质粒就是带有LUC报告基因的质粒载体，我们可以利用这一系列的工具载体研究果蝇中基因的表达调控方式，其中pGL3Control带有SV40的启动子和增强子。SV40是一种猴病毒， 它的增强子/启动子区域可使其在大多数细胞株中有高度的组成性表达，因而广泛用于构建真核基因的表达载体，因此pGL3Control可作为检测体系中的阳性对照。但由于SV40启动子在果蝇S2细胞中不表达，所以我们将果蝇actin 5C 蛋白的启动子（pac）[4]构建到质粒pGL3Basic中，得到了高表达LUC的重组载体pGL3pac。这一质粒的构建可为研究果蝇中基因的调控方式奠定基础，同时也可为研究其他报告基因在不同细胞中的表达提供借鉴作用。 1 材料和方法 菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5α（作者所在实验室保存），质粒pGL3Basic(Promega公司)，/V5His/LacZ(Invitrogen公司)，限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ及T4连接酶、DNA聚合酶(TaKaRa公司)，小量胶回收试剂盒(TaKaRa公司)，中量质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)，LUC检测试剂盒(Promega公司)，S2细胞Schneider培养基(Invitrogen公司)，胎牛血清（Gibco公司）。 12 方法 pac启动子的获得 以/V5His/LacZ质粒为模板进行PCR扩增。上游引物5′GCGCCTCGAGCTTCAAGGAATTAATTCTATATTCT3′,下游引物5′GCGCAAGCTTGGTCTCTGGATTAGACGACT3′（划线部分分别为XhoⅠ和HindⅢ酶切位点）。PCR反应参数为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30个循环； 72 ℃延伸10 min。 重组质粒的构建鉴定与中量抽提纯化 PCR产物分别经XhoⅠ、HindⅢ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收酶切片段，与同样经酶切、割胶回收的pGL3Basic质粒于16 ℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含氨苄青霉素（终质量浓度为50 mg?L-1）的固体培养基上，37 ℃过夜培养。挑阳性克隆提取质粒，酶切和测序鉴定，鉴定正确的质粒经中量质粒抽提试剂盒提取纯化。 S2细胞培养及瞬时转染 S2细胞由本实验室冻存，使用Schneider培养基，补以10%胎牛血清。S2细胞培养在28 ℃无CO2培养箱中，根据其生长状态，按一定比例每3 d传代1次。待细胞生长状态良好时进行瞬时转染分析。转染时在12孔板中接种1×106个细胞，加入1 ml含10%胎牛血清的Schneider培养基，置28 ℃无CO2培养箱中培养6～16 h[细