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第五章 应用微生物的基因操作系统 大肠杆菌系统 酿酒酵母系统 大肠杆菌系统 大肠杆菌系统的特点 载体 质粒载体 噬菌体载体 粘粒(cosmid)载体 受体 感受态(competance)细胞转化 大肠杆菌系统的特点 基因工程是从大肠杆菌系统发展起来的 生长迅速 技术成熟 基因组测序完成 大肠杆菌系统的质粒载体 第一代质粒载体：pBR322 第二代质粒载体： pUC质粒 第三代质粒载体 pBR322 早期应用广泛的克隆载体，4362bp，有Ap和Tc两个抗药性基因 单一切点的限制酶：AvaI, PstI, BamHI, PvuII, ClaI, SalI, EcoRI, HindIII Ap: PstI Tc: BamHI, HindIII, SalI pBR322载体重组子的筛选 Aps Tcs Ap Tc+CycS Apr Tcr ------? Apr Tcr -----------? Apr Tcs Apr Tcs Apr Tcs D-cycloserin: D-Ala（细胞壁组分之一）的结构类似物 pUC质粒 Ap抗性 LacOZ中有多克隆位点(MCS)，可在X-gal平板上直接挑选 5溴,4氯,3吲哚－β－半乳糖苷 （无色） β－半乳糖苷酶 （蓝色） 第三代质粒载体 pBR322（复制原点，抗药性） T-噬菌体启动子、Lac启动子 多克隆位点 His尾 穿梭质粒 质粒一般只能在特定的寄主中复制，能穿梭于不同寄主中复制的质粒称为穿梭质粒。 大肠杆菌系统的成熟性，带来了穿梭质粒载体使用上的方便性。 λ 噬菌体类载体 可容纳的较大的外源DNA片段 进入细菌细胞容易 能裂解宿主细胞，提取容易 组建的DNA或cDNA文库易于长期保存 λ噬菌体基因组 双链DNA,48502bp,50基因 EcoRI (12bp)cos A F J att int rec N CI P Q S R cos 头尾合成 重组区 调节区 复制区 裂解区 J-N为非必须区，与噬菌体生长及噬斑形成无关，可被消除或取代，当λ-DNA分子大小为其全长的78%-108%(38~52 kb)时，可以形成感染性噬菌体颗粒。 λ 噬菌体类载体的构建 用突变、缺失等方法，减少限制酶的切割位点，除去必须区内的限制酶位点。 ?EcoR I ?S I ?ligase 在非必须区内进行基因操作，切除一定的DNA片断，有目的的引入一些DNA片断。 插入型载体 λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有一个酶切位点，DNA重组时外源DNA将在这个位点插入。 EcoR I b538 CI imm434 整个基因组缺失18%，最大插入为 9 kb CI:编码使噬菌体不能复制的阻遏蛋白，噬菌斑混浊，插入后CI失活，噬菌斑透亮 取代型载体 λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有2个酶切位点，DNA重组时外源DNA将取代这2个位点间的片段。 EcoR I EcoR I SupE 整个基因组缺失27%，可插入 3-18 kb SupE，抑制基因，抑制LacZ基因的amber突变体，在X-gal平板上产生蓝色噬菌斑,取代后噬菌斑无色 λ噬菌体载体与外源DNA重组 粘粒(cosmid)载体 插入外源DNA片断的大小： 质粒：10kb 噬菌体：10-20kb 粘粒：40kb 粘粒(5-10kb): COS+抗药性基因+限制酶单切位点 粘粒 ? 限制酶酶切 ? 连接外源DNA(ligase) ? 体外包装（需要2株带λ溶源突变体的E.coli，冻融后提取包装所需的各种蛋白质）?