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医学真菌生物膜研究进展Biofilms: a New Perspective on Fungal Infection 第二军医大学长征医院皮肤科 廖万清 医学真菌学 它是研究病原真菌和条件致病真菌对人类致病机制、诊断、治疗和预防的一门重要学科，属交叉、边缘学科。 真菌按其菌落形态分为 特征：多细胞，有菌丝和孢子，基本形态是菌丝 特征：在感染组织内寄生或在37℃高营养培养基培养时是酵母相，在体外腐生和27℃培养时呈菌丝相 真菌的致病方式 真菌毒素中毒症：黄曲霉毒素, 镰刀菌毒 素。 变态反应性疾病：多形性红斑，外源性变态反应性肺泡炎。 浅部真菌病: 皮肤及附属器官感染。 深部真菌病: 局限性及系统性。 各种原因导致真菌感染患者增加 美国流行病学研究发现,1980至1982年与1992至1993年相比,念珠菌病发病率由2.6/100万/年上升至72.8/100万/年;隐球菌病由4.0/100万增至65.5/100万/年;曲霉病由8.4/100万/年增至12.4/100万/年。 北京协和医院1953至1993年间尸检结果显示，后20年深部真菌感染率由1.5%增至5.6%。 上述原因导致机会致病真菌感染的病例大幅增加，有许多感染反复难愈。其中有相当多的病例已经证实与真菌的生物膜形成有关。 一. 生物膜的形成和结构 生物膜(biofilm) 定义：是一种附着于活组织或无活力的组织表面、由其自身产生的细胞外多聚基质(extracellular maxtrix,ECM)包裹的有结构的菌细胞群体，由ECM以及被其粘连的菌细胞构成。 它是相对于游离状态菌细胞而言的另一种微生物的存在方式。它可以保护菌细胞，明显降低隐球菌等致病真菌对抗真菌药物的敏感性，甚至耐药。 近年来已发现包括主要的人类致病真菌在内的多种真菌可以形成生物膜。 念珠菌可以形成生物膜且念珠菌形成的生物膜有对抗宿主防御机制的作用，并使得念珠菌对临床常规抗真菌药物明显耐药。Walsh等则最早报道了一个隐球菌生物膜形成的病例，该病人在心室心房分流术后心导管表面生长的微生物薄膜经培养确定为新生隐球菌，薄膜超微结构符合生物膜的结构特点，首次证实新生隐球菌也可以产生生物膜。Reynolds 发现酿酒酵母生物膜的存在。 ① 菌体与支撑物表面的粘附。 ②形成微菌落。 ③微菌落融合并释放基质形成生物膜的基底层。 ④基质大量释放；同时伴随菌丝和或假菌丝的形成,结构逐渐复杂。 ⑤细菌或真菌细胞从生物膜释放出来，形成新的生物膜 生物膜的结构 以白念珠菌生物膜为例。 最初的2h：白念珠菌细胞主要以芽生孢子的形态附着于支撑物表面。 4h后：开始形成芽管，出现分散的微菌落，并逐渐融合。 中期的开始阶段(12～14 h)：主要是以细胞外基质的出现为特点，细胞外基质覆盖在真菌微菌落表面，随时间推移不断增多，直至将细胞完全包裹。 成熟期：形成在细胞外基质包裹下的由孢子、菌丝和假菌丝组成的致密的网状系统，呈有机的三维结构。 标尺均为10μm 新生隐球菌的生物膜 早 期：酵母细胞和出芽孢子形成单层结构； 中 期：逐渐形成菌落； 成熟期：产生大量荚膜多糖和细胞外物质，将大量酵母细胞连成三维网状结构。 早期：A、B 出芽、单层生长 中期：C、D 微菌落形成 成熟期：E、F 荚膜多糖释放、细胞外基质形成并包裹数层酵母细胞 成熟的C. neoformans B3501生物膜(生长于盖玻片，电镜下) 可见多糖物质将酵母细胞连接在一起(箭头所示)。 二. 生物膜形成的影响因素 生物膜的形成受到多种因素影响：附着组织类型、血清成分等，在体外培养则还受到培养基类型的影响。如下所述。 血清及组织液成分 血清及组织液的某些成分可促进生物膜形成。 在相同材质的支撑物上，相较与体外生物膜，体内生物膜的胞外基质更厚，而且体内生物膜完全成熟所需要的时间更短。 容量感应(Quorum-sensing) 近年来的研究表明，容量感应分子在生物膜形成上的重大作用，它使得生物膜不再是浮游细胞的简单聚集。白念珠菌的容量感应分子有法尼醇(Farnesol)和酪醇(tyrosol)。 其中法尼醇与生物膜形成有关，另外它还可以抑制白念珠菌的菌丝化。 实验证实，用法尼醇处理白念珠菌的黏附细胞群落可以抑制其生物膜的形成和生长，其作用依赖于浓度和法尼醇处理时的黏附时间。 在经法尼醇处理的白念珠菌所形成的生物膜中，有274个基因的表达发生改变，包括菌丝形成相关基因、细胞壁维持相关基因、细胞表面疏水性相关基因以及离子运输相关基因等。 法尼醇是否通过抑制菌丝化来抑制生物膜的形成目前尚不清楚。 目前仅有少量证