单核细胞增生李斯特菌检验讲解课件.ppt

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验 李斯特氏菌属 李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。 单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例，死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。 按2009年国家食源性疾病检测网的工作手册 1.定性检测 2.定量检测 检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质 0.1 mL+10 mL LB2增菌液 科玛嘉李斯特菌显色培养基 PALCAM琼脂 接种木糖、鼠李糖，36 ℃±1 ℃，24 h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30 ℃±1 ℃，24 h～48 h 木糖-，鼠李糖+ 鉴定 结果报告 30 ℃±1 ℃，24 h 30 ℃±1 ℃，18 h～24 h 36 ℃±1 ℃，24 h～48 h 增菌培养:LB1增菌液225 mL，于30℃培养24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。 分离培养:LB2 二次增菌液转种于选择培养基PALCAM和科玛嘉琼脂平板上，于37℃培养24 h，观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。 MMA PALCAM OXA CHROMagar 30℃48h菌落针尖大小、形态不典型，与杂菌难区分抑制性强 37℃24h－48h，2mm灰绿色中心黑色凹陷，菌落周围呈棕黑色水解圈 30℃24h－48h,2mm灰黑色菌落周围呈棕黑色水解圈 37℃18h-24h,蓝色菌落周围呈白色晕圈 表1 单核细胞增生李斯特菌在选择性平板上的菌落特征 选择性琼脂平板单核细胞增生李斯特菌科玛嘉显色培养基菌落为:蓝色，周围有白色晕圈. PALCAM琼脂菌落:为灰绿色，小的圆形菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷 L.M在 Chromagar培养基生长特征 L.M在OXA培养基生长特征 L.M在PALCAM培养基生长特征 MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与杂菌区分 进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂菌区分 CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对高污染食品中的杂菌抑制性较差 染色镜检 将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。 该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物中呈短小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状，在老龄培养物中呈长丝的长杆菌状，有些细菌因此而变成革兰氏阴性；为需氧或兼性厌氧菌，在20～25℃培养时能形成4根鞭毛，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛，运动消失。?????????  1.初筛 在我们前期工作中发现，高污染样品在选择性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。 初筛及纯培养 自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于37℃培养24h；同时在胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）平板上划线纯化，于30℃培养24h-48h。木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色，在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。 单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别 菌种 溶血反应 协同溶血 葡萄糖 麦芽糖 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七叶苷 单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes) ＋ ＋ ＋