细菌耐药-教材.ppt

细菌耐药机制及检测; 一、细菌耐药的遗传机制 细菌耐药性的遗传学机制主要指细菌的耐药性通过基因突变(即染色体介导的耐药性)获得，或通过质粒或转座子水平传播获得外源耐药性基因，也可通过整合子捕获外源基因使之转变为功能性基因来传播耐药性。;1、染色体介导的耐药 2、质粒介导的耐药 3、整合子介导的耐药 ;二、细菌耐药的化学机制 （一）产生灭活抗生素的各种酶 (二 ) 膜通透性下降 （三）抗菌药物作用靶位改变 （四）细菌主动药物外排机制 （五）细菌生物被膜的形成;几种常见的可灭活抗生素的酶 1、β-内酰胺酶(β-lactamase) （1）超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases,ESBLs) （2）头孢菌素酶（AmpC酶） （3）碳青霉烯酶 （4）金属酶 2、氨基糖苷类抗菌药物钝化酶 3、MSL类钝化酶 4、氯霉素钝化酶 ;（二）耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS） （1）纸片筛选法：含4%NaCl的MH琼脂，30μg/片头孢西丁，33-35℃，24小时。对于金黄色葡萄球菌，抑菌环直径≤19mm，为MRSA，抑菌环直径≥20mm，为MSSA；对于凝固酶阴性葡萄球菌，抑菌环直径≤24mm，为MRCONS，抑菌环直径≥25mm，为MSCONS。 （2）琼脂筛选法：MH琼脂中加入6ug/ml苯唑西林、4%氯化钠，直接菌落悬液法，涂布接种，≤35℃，孵育至24小时。任何有生长的现象均为MRS。 （3）乳胶凝集或基因扩增法直接检测MecA基因。;（三）万古霉素中介或耐药的葡萄球菌，VIS或VRS 筛选方法：MH琼脂，万古霉素（30μg/片），抑菌环直径≤14mm应测MIC；肉汤稀释法MIC8～16μg/ml为VIS，MIC≥32μg/ml为VRS。任何耐万古霉素的葡萄球菌均应送参考实验室进一步检测。 ;（四）耐万古霉素的肠球菌 检测方法：30μg/片万古霉素，抑菌环≤14mm为耐万古霉素肠球菌。;（五）超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases ESBLs） （1）药敏推测法：根据ESBLs能水解三代头孢的原理进行检测。用标准琼脂扩散法测定头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢泊肟和头孢曲松的抑菌环直径，按NCCLS标准进行判断。凡头孢他啶抑菌环直径≤22mm、头孢泊肟抑菌环直径≤17mm、氨曲南或头孢噻肟抑菌环直径≤27mm、头孢曲松抑菌环直径≤25mm，任何一种药物抑菌环直径达到上述标准，或用稀释法检测上述药物的MIC大于等于2ug/ml,均疑为ESBLs菌株。应进一步作确证试验确诊。 （2）表型确证试验：根据ESBLs可被克拉维酸抑制的原理，按NCCLS推荐的指南进行操作，包括纸片法和稀释法。前者采用头孢他啶(30μg)及头孢他啶/克拉维酸(30μg/10μg)组合，头孢噻肟(30μg)及头孢噻肟/克拉维酸(30μg/10μg)组合，任一组药物的抑菌环的直径差≥5 mm时，判定为ESBLs阳性株。 ;（3）双纸片协同法：根据ESBLs可水解三代头孢，有可被克拉维酸抑制的原理，将阿莫西林/克拉维酸抑制纸片置于头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南中间，使两纸片中心间距为20～30mm，如果在阿莫西林/克拉维酸与任何一种纸片间出现协同抑菌现象,视为产ESBLs株。此法操作简便，特异性、灵敏度菌较好，可作为检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌产ESBLs的常规方法。 （4）头孢曲松三维试验：根据ESBLs可水解三代头孢，但不被氯唑西林抑制的特点，按标准纸片扩散法操作，取相当于0.5麦氏浊度的标准大肠埃希菌ATCC25922菌液，接种M-H琼脂平板，平板中心贴一30ug头孢曲松纸片，再距头孢曲松纸片5mm处分两个方向划两条长约15mm的狭缝，其中一条加40ul酶提取液，另一条加36ul酶提取液和4ul2*10000umol氯唑西林，35℃过夜，若单加酶提取液的狭缝和加酶提取液和氟氯西林的狭缝与抑菌圈交接处均出现扩大生长区域，视为ESBLs三维试验阳性。此法利用酶的粗提物检测，又用氯唑西林抑制，消除了其他酶存在对检测结果的影响，尤其适用于大肠埃希菌和克雷伯菌以外的革兰阴性杆菌ESBLs的检测。;（5）等电聚焦及克拉维酸抑制试验：将临床分离菌中粗提的未知ESBLs进行等电聚焦电泳，,测定其等电点(PI),与已知酶的ESBLs的PI进行比较,又根据克拉维酸可以抑制的ESBLs活性，而对其他β-内酰胺酶的活性无明显抑制作用的特性。可先用克拉维酸对凝胶板上的酶进行抑制，再用头孢硝噻吩进行显色反应，可进行ESBLs的检测和分型。 （6）产酶基因的检测：提取待测菌的DNA作为扩增模板,采用已知标准酶基因的特异性引物,进行体外循环扩增,结果如为