第十八章 节 高效液相色谱法课件.ppt

一、HPLC与经典LC区别;4.HPLC:分析时间大大缩短; 经典LC: 分析周期长 ;5.HPLC:可以在线检测: 经典LC:无法在线检测; HPLC：流动相为液体 ;第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 ; 弱极性组分先出柱,强极性组分后出柱;正相色谱法— 固定液极性 流动相极性 极性小的组分先出柱 反相色谱法—固定液极性流动相极性 极性大的组分先出柱;二、化学键合相色谱法 ;（一）正相键合相色谱法 ;4.分离机制 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用 5.分离选择性： 极性强的组分k大，后洗脱出柱,tR 增大。 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR 减小。;（二）反相键合相色谱法;4.分离机制（多种模型） 疏溶剂理论（solvophobic theory）;溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。 不是溶质分子与键合相间的色散力，;5.保留行为的主要影响因素 (1)、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 (2)、固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。 ;(3)、流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 1)溶剂比例：水的比例增加，使k增大 2)pH：影响弱酸、弱碱的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。;离子抑制色谱法（ion suppression chromatography；ISC ） 用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使k变大。 适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱;对于弱酸： 流动相pH降低，K增大，tR增大 对于弱碱： 流动相pH增大，K增大，tR增大 注：键合相允许使用的pH为2～8;1.固定相： ODS柱;3.离子对模型 ;4.影响组分保留行为的因素;第二节　高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择;1.非极性键合相 ：;2.弱极性键合相： 醚基和二羟基等键合相 用于反相或正相色谱 3.极???键合相： 常用氨基﹑氰基键合硅胶(氨基柱、氰基柱） 一般用于正相色谱 ;（1）使用过程中不流失； （2）化学稳定性好； （3）适于梯度洗脱； （3）载样量大 ;二、化学键合相色谱法的流动相 （自学）;三、分离条件的选择 ;固定相传质阻抗CS可以忽略 ，因df极小 流动相传质阻抗Cm ;原因：化学键合相，液体流动相 结果：HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。 ;（二）影响分离的因素 n由色谱柱（固定相）性能决定， α主要受溶剂种类的影响， k受溶剂配比的影响。 ;(三)HPLC法分离条件的选择;3. 柱温的选择： 选室温25℃左右 4．洗脱方式 : 等度洗脱、梯度洗脱;第三节　高效液相色谱仪;一、输液系统;(二)输液泵应具备的性能： 1.流量精度高且稳定 2.流量范围宽 3.能在高压下连续工作 3.液缸容积小 4.密封性能好，耐腐蚀 ;(三)输液泵操作注意事项： 1.防止固体微粒进入泵体 2.流动相不应含有腐蚀性物质 3.防止溶剂瓶内的流动相被用完 4.不超过规定的最高压力 5.流动相一般应该先脱气 ;二、分离和进样系统 ;(二)色谱柱（column） ;三、检测系统;（二）紫外检测器(ultraviolet detector) ;3.局限： 只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。 4.专属型、浓度型检测器;5.紫外检测器分类;(3)光电二极管阵列检测器 (photodiode array detector； PDAD)： 一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光 ;紫外检测器;第四节 高效液相色谱分析方法 ;注：1) HPLC法中校正因子难从手册中查到，需自行测定。 待测组分纯品＋内标物——混合进样 fg=(Asmi) / (Aims ) 2) 内加法 试样 －－－－－－－－－－－－－－ 准确进样 试样(含待测)＋待测组分对照品－－ 准确进样;本章重点：