基因工程(基因工程的主要技术及原理-PCR技术).ppt

发展历史 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。 1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。 Saiki等人又在黄石公园从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。 3、引物 (Primer) 避免引物内部或引物之间存在互补序列(3个碱基)， 从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的 形成。 预变性（95oC，5min) 1、复性（退火）和延伸温度 2、反应时间 3、循环次数 4、PCR 反应液的配制 1.PCR产物的克隆 1)在PCR产物两端添加限制性酶切位点 2)A/T克隆法 2.反向PCR(reverse PCR)与染色体步移 3.不对称PCR(asymmetric PCR)与DNA测序 4.RT-PCR(reverse transcripton PCR)与RNA分析 基因的体外诱变及突变的检测 基因或基因组比较研究（RAPD） 医学、司法等 原因： 底物和引物的浓度已经降低， dNTP和DNA 聚合酶的稳定性或活性降低， 产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用， 非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用， 扩增产物自身复性， 高浓度扩增产物变性不彻底。 常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA 聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在 反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发； PCR反应液体系通常有20ul、25ul、50ul和 100ul体系几种。 五、PCR技术的应用 DNA克隆(DNA cloning)：是指将外源DNA片段插 入到克隆载体形成重组的DNA群体，并转化到寄 主细胞进行复制繁殖,以便从大分子的DNA或DNA 片段混合物中纯化并分离出特定的DNA片段的实 验操作过程。 为使PCR产物能够方便地装载到克隆载体上，可以 在扩增过程中，在其两端添加限制性酶切位点。 这种添加方式可以利用特定设计的引物通过扩增来 实现。 待克隆DNA S-primer 循环1 PCR扩增 酶切位点2 A-primer 酶切位点2 酶切位点1 循环2 循环3 酶切位点1 酶切位点2 酶切位点1 扩增产物 待克隆DNA片段 装载载体 A/T克隆法是目前使用最广泛的PCR产物克隆法，无须在产物末端添加酶切位点； 主要适用于Taq DNA聚合酶扩增的产物； Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可以在扩增的DNA片段3末端添加一个A(腺苷酸)； Taq DNA聚合酶扩增产物可与T-载体进行互补连接，从而达到高效克隆的目的。 A A A T T A T T PCR扩增产物 T-载体 连接 模板DNA 已知片段 未知片段 PCR扩增 能否利用PCR技术扩增出未知片段？ 未知片段 常规PCR的局限：只能扩增两引物之间的DNA片段。 限制性内 切酶切割 产生片段群 环化 P1 P2 反向扩增 产生片段群 未知片段 重复进行反向PCR便可用来作染色体步移； 但是，能被反向PCR扩增的DNA长度是有限的， 因此，利用此方法只能沿染色体分子做较短 的步移。 按照Sanger双脱氧链终止法测定DNA的核苷酸 序列，最好是使用单链模板DNA； 利用不对称PCR可以获得单链模板DNA。与普通 PCR的唯一区别是扩增所用的两种引物浓度相 差100倍； 低浓度的引物称为限制引物，一般0.5-1.0pmol； 在限制性引物用完之前，PCR扩增产物主要为双 链DNA； 25个循环之后，反应混合物中只有高浓度引物， 此时PCR扩增产物则只有双链DNA中的一条，并 以线性而非指数方式增加； 再经过10个循环的扩增，即可产生满足测序要 求的单链DNA模板。 RT-PCR是以反转录的cDNA作模板进行的PCR扩 增反应； mRNA的定量是随着在不同的时、空状态下，编码基因表达活性的变化而不同； RT-PCR可以用来检测和分析不同组织，或相同 组织不同发育阶段中mRNA的表达情况； * * 基 因 工 程 生物技术专业核心课程 淮阴师范学院 高清松 C 分子杂交技术 A 核酸的分离和纯化 B 核酸电泳 第三章 基因工程的主要技术及原理 E PCR技术 D DNA核苷酸序列分析 第五节 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) 1983年，由美国Kary Mullis发明的一种 体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法， 故又称为基因的体外扩增法，也可称为无 细胞分子克隆法。