两只小狮子课例分析.doc

植物表达载体构建 张玉刚 zyg4458@163.com 载体 vector 表达载体(expressing vector) 特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列 大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号 启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列 转录终止序列 启动子的种类 组成型启动子 诱导型启动子 组织特异型启动子 在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性 Constitutive promoter 在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平下，在不同组织部位表达水平没有明显差异。 特点：表达具持续性；tRNA和蛋白质表达量相对恒定；它们不表现时空特异性；不受外界因素的诱导；从结构上看，大多数组成型启动子转录起始位点上游几百个核苷酸处，存在有六聚体花纹（hexamer motifs)序列TGACTG。 它们以重复形式出现并被6-8个核苷酸隔开，缺失及点突变分析表明六聚体花纹的存在对维持启动子的转录活性是必要的。 CaMV 35S启动子 来自花椰菜花叶病毒，由于启动整个CaMV基因组的一小段重叠序列转录产物的沉降系数为35S，故将编码该转录产物的启动子称之为35S启动子。 该启动子包括TATA盒、CAAT盒、倒转重复序列和增强子核心序列（GTGG/TTTG）。 35S可以划分为两个区域： A区：-90~+8 主要负责在胚根、胚乳的根及根组织内表达； B区：-343~-90 主要控制胚的子叶及成熟植株的叶组织及维管组织内表达。B区内的增强子序列可以提高表达水平，如果35S启动子中存在两个B区将能使35S启动子的活性提高10倍， 并对异源启动子也有作用。 -75处 TGACGT核苷酸的重复的花纹结构对启动子表达能力有作用，如果其突变，将引起核因子与其结合力下降，导致启动子表达能力减弱。 CaMV35S启动子加上来自AMV的一段44bp的引导序列，可使其表达强度增加5倍（44bp序列是翻译增强序列）。 将加倍的CaMV35S启动子与AMV引导序列结合构成一个复合串联启动子，比未修饰的启动子表达增强20倍。 Tissue specific promoter 在这些启动子调控下，基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并通常表现出发育调节的特性。 这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在基础。与诱导型启动子有一定的共同点。 马铃薯块茎特异蛋白基因启动子 小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（ADPG-lucose pyrphosphorylase)启动子 番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturnase)启动子 花粉特异表达基因启动子（lat 52） 木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因(pal)启动子 Inducible promoter 在某些特定的物理或化学信号的刺激下，此种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，因此，称为诱导型调节序列。 共同特点 启动子的活化受到物理或化学信号的诱导； 启动子的分子结构都具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构； 感受特异性诱导的序列都有明显的专一性； 一部分该类型的启动子同时具有组织特异性表达的特点； 该类启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达启动子和共生细菌诱导表达基因启动子。 三种类型 A型：可以被植物体内合成的某些产物包括ABA、生长素、赤霉素以及创伤诱发产生的系统素所诱导； B型：在高温、低温、水淹以及土壤中高浓度的盐以及重金属离子等环境因子的作用下可被诱导； C型：一类能够对人工合成的化学诱导物，诸如四环素、地塞米松等作出反应。 光诱导启动子 核酮糖二磷酸羧化酶小亚基（SSrbc)基因和光扑获复合物a/b结合蛋白（light harvesting complex protein a/b, LHCP a/b)基因。 这两个基因均由核基因编码，并在胞浆内合成含有信号肽的前体蛋白，最终输入到叶绿体发挥生物学功能。 热诱导启动子 当植物暴露在高温下（通常35以上）或称热休克时，植物就会在1-3小时内暂时合成一些蛋白质或增大特异蛋白质的合成量，这些诱导下合成的蛋白质成为热休克蛋白。 热激基因的结构分析：这些基因的5 端有一段保守的热激共有序列，也称为热休克因子序列（HSE）。其含有热诱导基因表达的调控序列。 植物基因工程常用的报告基因 指其编码产物能够被快速地测定、常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达