基因表达研究技术与基因芯片数据分析.ppt

SAGE 技术的主要理论依据： 来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（9-11bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可作为区别转录物的标签（tag）； 选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性的9?10个碱基的核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应标签出现的频率确定基因的表达风度（abundance）。 SAGE特点： 进行转录物组研究，也就是转录水平的研究； 通过快速和详细分析成千上万个EST(Expressed sequence tags)来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息； SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息，这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的首选策略； SAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速； 检测方法 定义： 荧光原位杂交（Florescence In-Situ Hybridization, FISH）是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。 原理： FISH技术是将荧光基团标记特异性的DNA探针，再将标记了荧光信号的探针与待测样本进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数。通过荧光信号的颜色和数目的异常，达到疾病诊断的目的。 优点：1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年。2.方法敏感， 能迅速得到 结果。3.在同一标本上，可同时几种不同探针。4.不仅可用于分裂细胞染色体数量或 结构变化的研究，而且还可用于静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。 反义RNA作用 小结 1、基因表达系列分析技术 2、RNA选择性剪切 3、原位杂交技术 4、定点突变技术 5、RNAi技术 微阵列芯片制作的主要过程： 1、经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段； 2、用机械手将PCR产物点在玻璃板上，变性、固定； 3、分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成cDNA； 4、分别用Cy3（绿色）和Cy5（红色）两种荧光染料标记两种cDNA; 5、将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交； 6、激光扫描芯片杂交结果，计算机处理； 7、分析杂交数据。 双向电泳（two dimension electrophoresis，2－D）是分离混合蛋白质最常用的方法。 双向电泳由两部分构成：等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。 该方法是依赖于蛋白质的等电点的不同和相对分子质量的不同而构建的。 Laser 凝胶阻滞试验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA) 是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。是分离纯化特定DNA结合蛋白质的经典方法。 原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加分子量，而凝胶电泳中DNA朝正极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比，因此，没有结合蛋白质的DNA片段跑得很快，而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而跑得慢。当特定DNA片段与细胞提取物混合后，若复合物在凝胶电泳中的迁移率小，就说明该DNA可能与提取物中某个蛋白质分子发生 了相互作用。 噬菌体cDNA展示技术 以改构的噬菌体为载体， cDNA基因片段定向插入 噬菌体外壳蛋白基因区， 使外源蛋白表达并展示 于噬菌体表面， 通过亲和富集法筛选 表达有特异蛋白质的噬菌体。 由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白质可逆磷酸化过程，是生物体内一种普遍且重要的调节方式，控制着众多的生理生化反应和生物学过程。 细胞的生长发育、形态形成、细胞周期调控、基因表达、蛋白质合成以及神经功能、肌肉收缩等都离不开蛋白质特异性磷酸化。 小结 1、双向电泳技术 2、质谱技术 3、蛋白质免疫印迹实验 4、凝胶阻滞试验(EMSA) 5、噬菌体展示技术 6、免疫共沉淀技术 7、蛋白质磷酸化分析 1、基因表达系列分析技术的原理是什么？简单叙述SAGE的操作方法。 2、RNAi技术与基因敲除技术相比有什么优点？ 3、简单叙述微阵列基因芯片制作方法。 4、双向电泳技术是根据蛋白质的什么特性设计的？ 飞行时间质谱 到达检测器的时间由肽段的质量和其所带电荷数的比值(m/z)决定 溶液从毛细管流出，成为带电荷的雾滴 待分析的蛋白质以单电荷形式成为气态物质。 电喷雾电离使蛋白质分子比较容易成为多电荷离子，将大多数蛋白质的质荷比降低到质谱仪的检测范围之内，提高了质谱仪的分析能力 电喷雾质谱 质谱技术的应用