试验五人外周血单个核细胞的分离.DOC

免 疫 学 实 验 免疫学研究所 2006年8月 目 录 基础实验部分 第一部分 非特异性免疫功能检测 实验一 巨噬细胞吞噬功能试验…………………………… 1 第二部分 特异性体液免疫 实验二 抗体的常规检测……………………………………… 3 实验三 酶联免疫吸附实验（ELISA）………………………… 11 实验四 体外抗体形成细胞的检测………………………… 16 第三部分 细胞免疫功能检测 实验五 人外周血单个核细胞的分离……………………… 19 实验六 E-玫瑰花环形成实验……………………………… 21 实验七 淋巴细胞增殖实验………………………………… 22 第四部分 免疫病理 实验八 豚鼠过敏实验………………………………………… 26 第一部分 非特异性免疫功能检测 实验一 巨噬细胞吞噬功能实验 一、原理 巨噬细胞（Macrophage,MΦ）作为单核吞噬细胞系统的主要细胞，具有活跃的吞噬功能。能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。MΦ受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。在此，介绍两种小鼠腹腔M吞噬功能两种的方法： 1．体内法：在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射白色念珠菌，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷美兰染色，油镜下计数吞噬白色念珠菌的百分数，及观察MΦ内因被杀死而染为蓝色的白色念珠菌的形态、数目，以判断MΦ的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异免疫水平。 2．体外法：在体外将小鼠腹腔MΦ与白色念珠菌按比例混合，温育，以冷美兰染色，油镜下进行观察，观察指标同上。 二、实验材料 1．动物：小白鼠（雌或雄，20～22g）。 2．白色念珠菌悬液：接种于沙氏培养基的白色念珠菌，28℃培养18～24h，生理盐水洗下，配成1×10/ml细胞悬液。 3．无菌6%淀粉、无菌性注射器、针头、Hank’s液（含5%小牛血清）。 4．0.03%美兰（4℃存放）、华氏管、吸量管。 三、实验方法 （一）体内法 1．试验前3天，小白鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。 2．实验时，每只小鼠腹腔注射白色念珠菌菌液1ml，轻揉腹部，使菌液在腹腔中分布均匀，利于吞噬。 3．30分钟后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用接种环取出腹腔液，均匀涂布于载玻片上，然后再滴一小滴0.03%冷美兰，盖上盖玻片。 4．高倍镜下进行观察，计数。 （二）体外法： 1.将6%的消毒淀粉液1ml注入小鼠腹腔。 2.72h后，拉颈处死小鼠，剖腹，吸取腹腔液，1000rpm离心5min，收集M? 3.以Hank’s液洗涤MΦ，1000rpm离心5min，重复二次。 4.计数MΦ，以Hank’s液配制1×106个/ml细胞悬液。 5.取华氏管，加入等量的1×106个/ml的MΦ悬液及1×107/ml白色念珠菌菌液。 6.37℃，温育30min（中间摇动试管二次）。 7.500 rpm离心5min，弃上清液。 加盖玻片。 9.高倍镜观察并计数。 四、结果判断 1．计算方法 （1）吞噬百分率= ×100% （2）吞噬指数= ×100% （3）杀菌率= ×100% （杀死的细菌呈蓝色，活菌不着色） 2．正常值： （1）吞噬百分率：62.77±1.38 （2）吞噬指数：1.058±0.049 （3）杀菌率：因激活条件、观察计数时间的不同而表现不同（计算杀菌率应减去白色念珠菌的自然死亡率）。 五、注意事项 1. 吞噬用的白色念珠菌菌龄应在18～24h内，不能有假菌丝及出芽现象。 =1：10。 2～3次，以免 第二部分 特异性体液免疫 抗原与相应抗体相遇，可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀。此原理可用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或抗原）。实验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应。 一、凝集反应 直接凝集反应是指颗粒性抗原(如完整的细菌或细胞)与相应抗体在体外直接结合而出现的凝集反应。 直接凝集反应又可分为：玻片凝集和试管凝集。 （一）玻片凝集实验(人ABO 血型鉴定) 是用已知抗体与未知颗粒性抗原在玻片上直接结合而出现的凝集反应。 这类反应较简单、迅速，常用于抗原或抗体的定性检测。例如细菌的鉴定、分型及ABO血型鉴定。这里介绍人类的A