重组蛋白制备 课件.ppt

如何获得重组蛋白？;重组蛋白制备;重组表达载体构建;基因克隆;基因克隆程序;;基因克隆所需通用材料;基因克隆流程图;一、目的基因片段获取;PCR;PCR反应的三个基本步骤;PCR循环;PCR反应五要素;RT-PCR;反转录反应;二、限制性酶切反应;三、克隆载体－质粒;pUC18质粒图谱 ;pUC18多克隆位点;四、DNA连接反应;连接反应获取重组环状DNA分子;五、DNA转化反应;六、重组质粒鉴定方法;蛋白诱导表达;;一、重组蛋白表达系统;原核表达系统;;表达载体;表达质粒构成元件;;;;;真核表达系统;无细胞翻译系统;;;蛋白纯化;重组蛋白纯化标签;选择亲和标签时需考虑的因素;His标签和金属螯合亲和层析;;His标签优缺点;谷胱甘肽巯基转移酶蛋白标签(GST);几丁质结合肽;基于几丁质与几丁质结合结构域的亲合纯化;麦芽糖结合蛋白（MBP）;MBP标签亲合纯化;重组蛋白制备SDS－PAGE图谱;与抗生物素蛋白特异结合的亲和标签;基于亲合素与生物素的亲合纯化;FLAG标签，T7标签和S标签;亲和标签;亲和标签的去除;剪切方法;;其它蛋白纯化技术;层析技术在分离纯化中的应用;;;;;层析方法;酶在纯化过程中的一些技术难点： （一）杂质的除去 酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等 。 （1）pH和加热沉淀法 （2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋白。 ;（3）选择性变性法 利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可用2.5%三氯乙酸处理。 （4）核酸沉淀剂法 用核酸酶，将核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于离心分离。用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等。 （5）将酶与底物结合 酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，热稳定性大大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。;（二）脱盐和浓缩 1、脱盐 脱盐方法是透析和凝胶过滤。 2、浓缩 酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。 （三）酶的结晶 把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达50%以上），可使其结晶，酶的纯度经常有一定程度的提高。为研究蛋白质空间结构???供X射线衍射样品。;（四）酶分离和纯化工作的注意事项 1、防止酶蛋白变性 2、防止辅因子的流失 3、防止酶被蛋白水解酶降解