细胞生物学常用技术 课件.ppt

五、细胞内分子的示踪技术 用一定的方法显示细胞中的分子,并对其 在细胞内的代谢过程进行追踪. (一)同位素示踪技术 1.原理 同位素: 核外电子数相同 化学性质相同 原子核重量不同 放射性同位素:衰变 ; 2.应用 (1)条件 可检测、可摄入 (2)方法 放射自显影（autoradiography） 蛋白质 - aa DNA - T RNA - U 脉冲标记;A 放射性物质脉冲掺入活细胞 B 不同时间取样切片 C 暗处曝光 D 显影、定影 ;胰岛素合成分泌过程;(二) 抗体示踪技术 ;2. 抗体 + 电子致密物 电子显微镜 ;六、细胞分子生物学技术 1.聚合酶链式反应 （ polymerase chain reaction，PCR） 特异性体外DNA扩增技术 利用针对目的基因所设计的一对 特异寡核苷酸引物，以目的基因 为模板，以dNTP为原料，在DNA聚 合酶作用下进行的DNA体外合成技 术。; （1）反应体系：模板链 DNA 聚合酶 dNTP 引物 （primer） （与模板相应序列互补） （2）反应步骤： 变性 94℃ 退火 55℃ 延伸 72℃ ;2. Real time PCR 实时定量PCR (荧光定量PCR) 通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号 的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分 析。 ;3.核酸分子杂交 (1) Southern blotting – DNA 将凝胶分离的DNA转移到固相支持膜上,然后与存 在于液相中的标记探针进行杂交,以检测特定DNA序 列的技术. (2) Northern blotting – RNA ;A 基因组DNA的消化 B 琼脂糖凝胶电泳分离 C 转膜 D 杂交 E 放射自显影;(3) 原位杂交技术（in situ hybridization） 用核酸探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进 行杂交，以检测特定核酸分子在细胞内原有位置 的方法。;4.基因转移技术 应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源 基因转移到受体菌或细胞内，并使其在细胞内实 现转入基因的扩增或表达。 外源基因 细菌 转化 真核细胞 转染 ;(1)限制性核酸内切酶 限制性内切酶：识别DNA分子内 由4～8个碱基构成的特定序列 的酶，这些酶的识别位点大多 是“回文”序列。 粘性末端 平滑末端 ;(2) 质粒载体克隆;(3) 克隆基因的表达 在细菌中的表达;在动物细胞中的表达;5.抑制基因表达技术 研究基因功能及调控 疾病的防治 ;起始阶段： 双链RNA导入细胞 siRNA (21-23) （short interfering RNAs） 效应阶段： RNA诱导沉默复合物 RISC 解链 结合mRNA （RNA induced silencing complex） （降解）;6.免疫沉淀技术 ( immuno - precipitation,IP) 是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象而发展的可以研究蛋白质相互作用的方法。 研究蛋白质相互作用 基本过程 制备细胞裂解液 抗体-凝胶颗粒或磁珠孵育细胞裂解液 沉淀目的蛋白及相互作用蛋白 分析 SDS We