10第十讲 蛋白质的分离纯化讲解材料.ppt

第十讲 蛋白质的分离与纯化;第一节 分离纯化概述;三、如何理解分离纯化与分析检测（三个层次） 分析研究的需要——要求对样品进行分离纯化，消除干扰物：如：蛋白质、核酸等结构与功能关系的分析； 定量分析：消除干扰物质 物质分离纯化过程中离不开分析检测 —定向分离 分离对象的收集，含量、纯度、回收率检测； ——分离过程的控制与管理 分离纯化过程——即是定性和定量检测的过程 如：电泳、HPLC、GC、薄层层析等；;四、分离与纯化 1、纯化原理： 依据蛋白质（物质）的理化特性（溶解度、分子大小、形状和电荷等） 以及蛋白质在不同相态中的分配特性不同将目的蛋白质与其它成分彼此分离。 2、分离纯化分类（2大类）： 初级（粗制）分离 高级（精制）纯化 3、分离纯化基本程序（4个主要环节）： 材料预处理及细胞破碎 蛋白质的抽提 初级纯化 高级纯化;;第二节 纯化前处理;一、初级分离： 目的蛋白（物质）初步分离、浓缩、富集的过程。 将蛋白与非蛋白、不同种类的蛋白分离和目标蛋白富集的过程。 二、方法和原理（教材 P105—109） （一）沉淀分级： 盐析分级：中性盐（NH4SO4、Na2SO4等 有机溶剂分级： 等电点分级： 其它（热、盐复合物、酸碱变性、表面活性剂（三氯乙酸）等、PEG （二） 膜分离分级： 膜分离方法：微滤，透析，超滤，反渗透，电渗析 选择适当的膜孔径。 （三）离心分离：低速离心、高速离心、超速离心 （四）萃取（表面活性剂）、结晶等 方法之间的联合使用：盐析—等电点，离心—沉淀，沉淀—过滤，结晶—过滤等;（一）沉淀分级： 1、盐析： 盐溶：低盐浓度下，随着浓度升高，蛋白溶解度增大的现象。 盐析：继续提高盐浓度，蛋白溶解度下降并析出的现象。 盐析分级：依据不同的蛋白质在不同浓度盐溶液中溶解度不同将蛋白分离的过程。 （1）原理（见示意图，p105 ） 蛋白质是一种亲水胶体。盐与水分子亲和，破坏蛋白胶体的水化层，中和蛋白表面电荷，使蛋白分子间聚集而沉淀。（溶解过程？NaCl溶解？） 在一定浓度盐溶液中，不同蛋白质溶解度不同而彼此分离——分级分离。 若在蛋白???电点，沉淀效果更好。;2、有机溶剂沉淀法 蛋白质在有机溶剂（水）中的溶解度差异进行蛋白质分级分离的方法 （1）原理 降低溶液的介电常数，增加分子上不同电荷的引力、导致物质溶解度下降 有机溶剂与水作用，破坏蛋白质的水化层、导致蛋白相互聚集 蛋白质种类不同，有机溶剂沉淀浓度不同——分级分离 （2）特点 分辨率比盐析高、沉淀不需脱盐、容易过滤，规模化制备中比盐析应用广泛（多糖、核酸等）。 容易引起蛋白质分子变性而失活，要求低温操作，蛋白和酶的应用不如盐析普遍。 （3）有机溶剂选择 与水互溶；乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、DMSO、乙腈等。 常用：乙醇和丙酮，生产上常用乙醇，甲醇和丙酮有毒性残留。 （4）影响因素 低温：甚至-20℃—— 冷丙酮沉淀蛋白（如：200μl蛋白溶液+1ml冷丙酮） 浓度和pH，与盐析相同 金属离子：多价阳离子（Ca2+、Zn2+）与阴离子蛋白结合成复合物，电荷下降，易沉淀 离子强度：盐浓度太高、太低都不利于分离，以不超过5%，使用乙醇量不超过2倍体积为宜。 操作时，将有机溶剂加到蛋白溶液中，Why？;介电常数： 用于衡量绝缘体储存电能的性能的一个参数。 在外加电场时，介质会产生感应电荷，而削弱外加电场，原外加电场(真空中)与最终介质中电场比值即为介电常数。 它是两块金属板之间以绝缘材料为介质时的电容量与同样的两块板之间以空气为介质或真空时的电容量之比。 介电常数代表了电介质的极化程度， 也就是对电荷的束缚能力，介电常数越大，对电荷的束缚能力越强。 ;3、等电点沉淀法 不同的两性电解质具有不同等电点（pI）。 两性电解质分子上，静电荷为零，溶解度最低。 不同蛋白，pI不同 （1）注意事项： 蛋白与金属离子结合，等电点改变 （2）特点： 沉淀不完全 常用盐析法、有机溶剂法或其他沉淀方法结合使用;4、其他方法 （1）盐复合物沉淀法 金属复合盐法：阴离子蛋白，与金属离子结合形成沉淀，如： 亲羧酸、胺和杂环等含氮类——铜、锌、隔 亲羧酸含氮类—钙、镁、铅 亲硫氢基类—汞、银、铅 重要特性：蛋白—金属离子复合物的溶解度，对溶液的介电常数非常敏感，加入有机溶剂利于蛋白沉淀。 有机酸法：如：苦味酸(2，4，6-三硝基苯酚) 、鞣酸等（）、三氯乙酸 有机酸与分子中含氮功能基团形成复合物 特点：可逆结合—但蛋白易变性，需要加蛋白稳定剂 无机复合盐类：如：磷钨酸盐、磷钼酸盐等 复合物溶解度很低、蛋白极易沉淀析出 金属离子通过H2S，生成硫化物除去或用离子交换法除去 注意：常使蛋白发生不可逆沉淀，谨慎！;（2）选择性变性沉淀法 原理： 利用蛋白等生