实验二革兰氏(Gram)染色法、芽孢染色法.ppt

革兰氏染色法芽孢染色法 目的要求 1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类 鉴定中的重要性。 3、了解芽孢的形态特征。 4、巩固光学显微镜油镜的使用方法。 5、复习无菌操作和涂片染色技术。  革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 基本原理 G+的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈蓝紫色。 G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。 实验材料 细菌培养物 １.大肠杆菌24h的斜面培养物。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ２.葡萄球菌24h的斜面培养物。 载玻片、接种环、镊子、酒精灯、染色液、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水。 显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。 1、涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀。 2、乙醇脱色是革兰氏染色的关键环节，严格掌握脱色时间。 芽孢是某些细菌生长到一定阶段后，在菌体内形成的一种休眠体，一般呈圆形或椭圆形，具有壁厚、含水量低、抗逆性强的特点。 两个主要的产芽孢的菌属： Bacillus（芽孢杆菌属） Clostridium（梭状芽孢杆菌属） 1.菌种：枯草芽孢杆菌斜面培养物 2.染色剂：5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液 3.仪器或其他用具：载玻片，木夹子，酒精灯，显微镜等。 思考题 （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键为什么是乙醇脱色？ （2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？ （3）若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？ 预　习 细菌的荚膜染色法和鞭毛染色法 * * 实验二 第一部分：革兰氏染色法 制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水洗→脱色（95%乙醇3-4s）→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→观察 方法和步骤 步骤： 结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色 番红复染 涂片固定 革兰氏染色法（Gram Stain） 关键步骤及注意事项 第二部分：芽孢染色法 芽孢染色原理 芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难，当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内， 进入菌体的染料经水洗后被脱色，当用对比度大的复染色剂（蕃红液）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是芽孢和菌体更易区分。菌体呈红色而芽孢呈绿色。 芽孢染色结果 （芽孢呈绿色，营养体及芽孢囊呈红色） 实验器材 制片→染色（孔雀绿加热5min）→水洗→复染（番红2-3min）→水洗→干燥→镜检 实验方法： 切勿让染料干涸 实验报告 1 绘图表示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态，并注明两菌的革兰氏染色结果。 2 绘图表示你所观察到的枯草芽孢杆菌的芽孢形态特征（注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形态特征） * * *