基因工程原理与技术讲解-6-7.ppt

第六章 DNA 体外重组与重组分子导入受体细胞 DNA体外重组是指目的基因DNA片段与适当载体在DNA连接酶的作用下连接形成重组DNA分子的过程。 第一节 重组DNA分子的构建 一、DNA体外重组必须考虑的因素： ①实验步骤简单易行； ②连接效率较高； ③选择载体要易于重组子筛选； ④选择的连接方式要便于回收插入的外源DNA片段； ⑤外源基因必须在表达载体DNA的启动子控制之下，并置于正确的阅读框架之中。 ;二、外源基因片段与载体的连接方式 1、黏性末端连接法(黏性末端法) ①单酶切黏性末端连接法 ;碱性磷酸酶处理线性DNA载体防止载体自身环化;②双酶切黏性末端连接法 (取代式黏性末端连接法);2、平头末端连接法(平头末端法) ;3、同聚物加尾连接法(同聚物加尾法、同聚物接尾法) ;4、人工接头连接法(人工接头法) ①DNA连接子法(连接子法) ;②DNA衔接头法(衔接头法);第二节 重组DNA分子导入受体细胞 转化(transformation)是指将质粒载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程。 转染(transfection)是指将噬菌体载体或病毒载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程。 一、重组DNA向细菌细胞转入 1、感受态细胞热激转化法(化学转化法?) 感受态细胞是指处于能摄入外源 DNA的这种生理状态的细胞。 导入方式：42℃热激45~90s 转化效率：105~106转化子/μg;2、电击转化法(高压电穿孔法) 原理：将受体细胞置于一个适当的外加电场中，利用高压脉冲对细菌细胞的作用，使细胞表面形成暂时性的微孔，质粒DNA得以进入细胞质内，但细胞不会受到致命伤害，一旦脱离脉冲电场，被击穿的微孔即可复原。 影响因素：①电压大小(300~600V/cm)；②脉冲时间(20 ~100 ms)；③重组DNA量。 特点：操作简单，不需制备感受态细胞，适用于任何菌株。但需要昂贵的仪器设备。 转化效率：109~1010转化子/μg ;二、外源DNA向真核细胞转入 1、载体介导外源DNA转移(载体介导基因转移) 病毒载体、质粒载体 2、外源DNA直接转移(基因直接转移) ①磷酸钙沉淀法(DNA/磷酸钙共沉淀法) 原理：DNA溶液与适量的CaCl2溶液混合，再加入一定量的???酸盐溶液，逐步生成DNA-磷酸钙沉淀复合物。将适量的DNA-磷酸钙沉淀加入细胞培养液中，通过细胞的胞饮作用进入细胞质或进而转移到细胞核内，然后整合到染色体上，或游离于细胞质中逐渐被降解。 影响因素：a、沉淀中的DNA浓度，加受体DNA可提高转化效率；b、沉淀与细胞的保温时间。 ; ②脂质体介导法 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状脂质小泡结构，其大小一般为1~5um。 原理：脂质体与细胞膜之间发生融合，便把其携带的外源DNA转入细胞内或进入细胞核，最终实现基因的转移。 脂质体介导法的转染效率可达到磷酸钙沉淀法的5~100倍，但比DAEA-葡聚糖法低至少90％。 优点：脂质体制备程序简单、可进行常规消毒灭菌、毒性小、包装容量大以及保护DNA免受核酸酶的降解等。 缺点：效率低。 ; ③DEAE-葡聚糖法 DEAE-葡聚糖是一种高分子多聚阳离子化合物，能与外源DNA结合成复合物，然后通过细胞的胞吞作用使DNA进入细胞而实现基因转移。 ④血影细胞介导法 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗等条件下发生溶血，使血红蛋白大量溢出，最后形成仅有细胞膜包被的细胞结构。 让携带外源DNA的血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而将外源DNA导入受体细胞。 此外，电击法、基因枪法、PEG法、精子介导法、花粉管通道法、微注射法………… ;第七章 重组子(转化子或克隆)的筛选与鉴定 重组子是指目的DNA片段与载体连接形成重组DNA分子。 转化子(转化体、克隆)是指导入外源DNA后获得了新的遗传标志的受体细胞或由此而来的组织、生物体。 ;第一节 遗传学筛选法 一、根据载体表型特征的筛选(选择标记) 简单、快速、效率高。也称为平板筛选法 1、抗药性标记插入失活筛选法 ;2、β-半乳糖苷酶显色反应筛选法(α-筛选或蓝白斑筛选);二、根据插入基因