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基因工程原理;;;;;;第一章基因与基因工程;1.2基因工程的诞生 理论基础：1.遗传的物质基础DNA 2.基因的自我复制和传递（1953） 3. 遗传信息的流向及表达问题的阐明（1961操纵子；1966中心法则） ;1.3基因工程研究内容 基因工程：在体外将核酸分子插入病毒，质粒或其他的载体分子上，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定的遗传。 内容（步骤） 1.分离目的DNA片段 2.与载体相连成重组DNA分子 3.重组DNA分子引入受体细胞 4.扩增，获得大量细胞繁殖群体 5.筛选具有重组DNA分子的细胞克隆 6.目的基因实现功能蛋白的表达 ;;第二章 基本技术;;2.2细胞转化 存在问题：外源DNA片段难直接导入受体细胞 即使进入无法复制 诱导受体菌成感受态 ; 2.3核酸分子杂交 1.种类：Southern,Northern 2.原理：互补的DNA或RNA混合，同源区段退火形成双链结构 3.步骤：核酸印迹转移， 核酸杂交 （ Southern硝酸纤维素滤膜，尼龙膜； Northern叠氮化的活性滤膜） 4.用途：亲缘关系，核酸片段中某一特定基因的位置;;; 2.4 DNA序列分析 Maxam,Gilbert化学裂解法；Sanger双脱氧链末端终止法 Sanger双脱氧链末端终止法 原理：2`,3`-双脱氧核苷三磷酸参入寡核苷酸链的3`末端，无3`-OH末端。反应终止。;;;Maxam,Gilbert化学裂解法 原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基特异切割。;;;;第三章 基因操作的工具酶;3.1限制性核酸内切酶 定义 分类：Ⅰ，*Ⅱ，Ⅲ （*1970H.O.Smith,K.W.Wilcon从流感嗜血菌Rd株分离） 命名：R.Hind Ⅲ Ⅱ型基本特征：特异识别序列， 断裂类型（粘性，平） 影响活性因素：纯度，甲基化，分子结构，温度， 缓冲液 ;;;同尾酶，同裂酶;;3.2DNA连接酶（1967） 作用机理：封闭双螺旋DNA上缺口 类型：DNA连接酶, T4DNA连接酶 ;;DNA片段的连接： 粘性末端 平末端（1） T4DNA连接酶 （2）同聚物加尾法：末端脱氧核苷酸转移??? 3`-OH （3）衔接物连接法：10-12，酶识别位点 （4）接头连接法：粘，平 ;;;;;;3.3DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 1957，美，Kornberg 1.多功能 5`-3`聚合酶；5`-3`外切酶；3`-5`外切酶 2.DNA杂交探针的制备 缺口转移法;;;;;大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（ Klenow 酶） 1.活性 5`-3`聚合酶；3`-5`外切酶 2.用途 修补3`隐蔽末端； 标记DNA片段末端； CDNA克隆的第2链CDNA的合成； DNA测序 ;;T4DNA聚合酶 5`-3`聚合酶；3`-5`外切酶;;逆转录酶 1.活性 RNA依赖的DNA聚合酶； DNA依赖的DNA聚合酶； 外切酶活性;;;3.4DNA和RNA的修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶； T4多核苷酸激酶； 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾 ;T4多核苷酸激酶与DNA分子的5`末端的标记;碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用;第四章 基因克隆载体;4.1质粒载体 天然质粒：F，R，Col 天然质粒特性 双链闭合环状DNA分子 复制类型 不亲和性 ;;质粒载体的选择 质粒载体具备条件： 自主复制； 限制酶单一切割位点； 筛选标记； 小，多拷贝 大肠杆菌质粒载体： PSC101，9.09kb；（1973） ColE1，6.3kb； pBR322，4.3kb ;;;;4.2噬菌体载体 噬菌体一般特性 核酸，蛋白质外壳 温和，烈性 λ噬菌体载体(1974) 1.λ