基因工程6-1表达载体2cmx演示教学.ppt

谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因产物的融合体，即融合蛋白，具有酶的活性。 p90 组成成分： 含有启动子(tac)及lac操纵基因、 SD序列 谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因，蛋白酶切割位点序列，克隆的外源基因则与GST基因及蛋白酶切割位点相连。 pGEX-6P-3 肠激酶 该载体具有以下优点： ①可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。 ②融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。 P90倒数2段 该载体具有以下优点： ③可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。在pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶(如凝血酶、prescission protease，Factor Xa)识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以，近年来该系统已广泛地应用于基因表达、分子免疫学、疫苗生产及DNA蛋白质相互作用的研究等。 pGEX-6P-3 肠激酶 凝血酶 Xa 因子 肠激酶 （4）6×His标签融合蛋白表达系统 该系统为Ni-NTA基质对带6个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统， 优点：①6×His比其它标记更小，可用于任何表达系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把6×His切除（也可用Xa因子切除）。②生理pH条件下6×His不带电荷，所以不影响蛋白质的分泌。③因5×His免疫原性差，所以无需去除6×His, 重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。 （5）内含肽标签表达载体 pTWIN1 和 pTWIN2 载体可以将目的蛋白融合在两个mini 内含肽之间便于进行蛋白纯化和后续操作，如蛋白环化和连接。 pTWIN1 载体中的内含肽分别为 Mxe GyrA 内含肽和来自蓝细菌（Synechocystis sp.）dnaB 基因的 Ssp DnaB 内含肽。 pTWIN2 载体中的内含肽分别为 Ssp DnaB 内含肽和来自嗜热自养甲烷杆菌（Methanobacterium thermoautotrophicum）rir1基因的 Mth RIR1 内含肽。 内含肽-目的蛋白的融和蛋白可通过几丁质结合域结合到几丁质珠上，便于纯化。分离洗脱目的蛋白可通过改变 pH 值和温度后，再加入硫醇试剂来进行。pTWI N1 和pTWIN2 载体的多克隆位点信息请见 NEB 网站。 CBD 几丁质结合域 intein内含肽 MCS 多克隆位点 （8）分泌表达载体 除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。 这种表达方式可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除 N-- 末端的甲硫氨酸，从而达到维护目标蛋白活性的目的。 利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌到细胞外，可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质 A 的信号肽。 ori Ampr rrnB T1T2 MCS Plac Lac O Lac I RBS IPTG Lac Iq Lac I Lac I 6His, GST, FBD,CBD,zz, intein 6His, GST, FBD,CBD Xa et al Xa et al 大肠杆菌 signal peptide 表达载体调控展示 ori Ampr rrnB T1T2 MCS Ptac Lac O Lac I RBS IPTG Lac Iq Lac I Lac I 6His, GST, FBD,CBD 6His, GST, FBD,CBD Xa et al Xa et al Ptac 大肠杆菌 signal peptide 表达载体调控展示 ori Ampr rrnB T1T2 MCS PL,PR cI(ts857) RBS cI(ts857) 6His, GST, FBD,CBD Xa et al 大肠杆菌 30℃,40 ℃ signal peptide 表达载体调控展示 第四节 表达载体p87 expressing vector GST-VP110c 的表达和纯化的SDSM. 低分子量标准蛋白； pET-GST 空载体诱导表达； 2. pET-GST-VP110c 未诱导菌液； 3. pET-GST-VP110c 诱导表达； 4. 纯化的蛋白。 极端例子：病原体蛋白，珍稀生物，人 表达载体 由克隆载体改造而来，按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆