基因工程-核酸杂交演示教学.ppt

Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 电转移示意图 第三节 核酸分子杂交技术一、固相杂交-Southern印迹杂交 Northern印迹(Northern blot)杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术 是由Alwine于1977年建立的。后经Thomas等人改进 主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情况 第三节 核酸分子杂交技术一、固相杂交-Northern印迹杂交 Northern印迹杂交流程图 第三节 核酸分子杂交技术一、固相杂交-Northern印迹杂交 第二节 核酸探针 一、核酸探针的类型 二、核酸探针的标记 三、标记探针的纯化和检测 第二节 核酸探针一、核酸探针的类型 核酸探针（nucleic acid probe)：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。 选择探针的最基本的原则 高度特异性 探针的来源是否方便 制备探针的难易程度 第二节 核酸探针一、核酸探针的类型 第二节 核酸探针一、核酸探针的类型 核酸探针的类型 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部或部分序列 制备方法: 基因克隆的方法 聚合酶链反应(PCR) 特点: 多克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，取之不尽 PCR制备探针简便和省时 相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟 第二节 核酸探针一、核酸探针的类型-基因组DNA探针 cDNA(complementary DNA)：是指与mRNA互补的DNA分子 特点: 不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究。 第二节 核酸探针一、核酸探针的类型-cDNA探针 RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高。 RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合。 RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未杂交的探针分子水解可用RNA酶去除，本底的干扰低。 RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。 第二节 核酸探针一、核酸探针的类型-RNA探针 特点 : 根据需要来合成相应的核酸序列，避免天然探针的缺点 探针长度一般为10～50bp 尤其适合点突变的检测 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱 ，但经过精心设计仍可设计出非常 特异的寡核苷酸探针 第二节 核酸探针一、核酸探针的类型-寡核苷酸探针 探针长度：一般要求在10～50bp G／C含量为40％～60％ 探针分子中应避免互补序列 避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或 -CCCC- 借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较 第二节 核酸探针一、核酸探针的类型-设计原则 理想的探针标记物应具有以下特点 检测物要灵敏、特异、稳定、简便 标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值 标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉 标记物对检测方法无干扰。 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记 放射性同位素标记 非放射性标记 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记 常用标记探针的同位素 32P：β，半衰期短（14.3d），标记核苷三磷酸，灵敏度很高，分辨率不高。 35S： β，标记蛋氨酸或取代核苷酸α位磷酸基中的氧，灵敏度高，分辨率较高，核酸序列测定和原位杂交。 3H： β，半衰期长（4417d），使用较少。 125I：γ，分辨率高，操作简单，安全防护要求较高，原位杂交。 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记-放射性同位素标记 同位素标记探针的优缺点 优点：检测灵敏度极高，10-14～10-18g，特异性强，对各种酶促反应几乎无影响，不影响碱基配对。 缺点：放射性污染，半衰期限制，高活性对核酸的破坏。 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记-放射性同位素标记 1.缺口平移法（双链） 2．随机引物法 （单链） 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记-同位素标记方法 3．DNA探针的末端标记   T4 DNA聚合酶标记3′-端DNA探针 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记-同位素标记方法 4．PCR标记DNA探针 标记率高 重复性好 简便快速 可大量制备 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记-同位素标记方法 5．单向体外转录制备RNA探针   第二节 核酸探针二、核酸探针的标记-