试验七HRP结合物的过碘酸钠交联法一试验原理.PPT

一 实验原理 HRP即辣根过氧化物酶，其分子上的活性氨基很少，用常规的戊二醇交联法使HRP与IgG形成结合物时，其交联产率很低，一般只有2-5%的酶被结合到IgG上。HRP中的糖基部分与其酶活性无关。如果用过碘酸钠将HRP中残糖基上的部分羟基氧化成醛基后，则可通过与IgG的氨基以Schiff碱的形式结合。用这种方法可将大约70%的HRP和99%的IgG结合到结合物上，一个活化的HRP酶分子可交联两个或更多个IgG分子而形成高分子量的结合物，可大幅度提高ELISA的检测灵敏度。 1．试剂 ⑴ PH 8.1，0.3M NaHCO3（现配）：0.504g NaHCO3加水至20ml ⑵ 1%氟硝基苯无水乙醇（现配）：0.1ml氟硝基苯加无水乙醇9.9ml ⑶ 0.06M过碘酸钠（现配）：0.257g NaIO4加水至20ml ⑷ 0.16M乙二醇：0.1ml乙二醇加水至10ml ⑸ PH9.5，0.1MCBS：30ml 0.1M Na2CO3加入70ml 0.1M NaHCO3 ⑹ PH9.5，0.01MCBS：试剂⑸稀释10倍 1．试剂 ⑺ HRP：＞250μ/mg ⑻ 饱和硫酸铵溶液 ⑼ PH7.4，0.02MPBS ⑽ NaHB4 ⑾ 硫柳汞 ⑿ 17mM PMSF异丙醇溶液（现配） 2．器材 ⑴搅拌器 ⑵透析袋 ⑶离心机 ⑷紫外分光光度计 1 称取5mgHRP，加入1ml PH8.1，0.3M NaHCO3溶液，轻轻搅拌溶解。 2 在搅拌情况下，滴加0.1ml 1%氟硝基苯无水乙醇溶液，室温避光反应1小时。 3 加入1ml 0.06M过碘酸钠，室温轻轻搅拌反应30分钟，此时溶液变为黄绿色。 4 加入1ml 0.16M 乙二醇溶液，室温轻轻搅拌1小时，终止过碘酸钠的氧化反应，将溶液装入已处理的透析袋中，放入1000ml PH9.5，0.01MCBS溶液中透析，4℃，搅拌过夜，中途换液2-3次。 5 取出透析液，置于试管中，加入5ml IgG（IgG预先溶解于1ml PH9.5，0.1MCBS中），室温避光轻轻搅拌反应3小时。 6 加入5mg NaHB4 ,4℃，3小时。 7 上述溶液装入透析袋，在PH7.4，0.02M PBS中透析24小时，中途换液数次。 8 在搅拌情况下，滴加等量饱和硫酸铵溶液，4℃，放置1小时，离心，3000rpm，30分钟。 9 沉淀溶于少量PH 7.4，0.02M PBS，装入透析袋后在PH 7.4，0.02M PBS中透析12小时，中途换液数次。 10 用紫外分光光度计测定透析液的OD403及OD280。加入适量的PMSF稳定HRP的活性，最终浓度为0.5mM：加入0.1%-0.2%硫柳汞防腐，分装成小管，-4℃存放。根据下列公式计算交联IgG和HRP的含量。 [IgG]B=（OD280-OD403×0.3）×0.62（mg/ml） [HRP] B= OD403×0.4（mg/ml） 1 操作过程中，加入氟硝基苯及硼氢化钠，有什么作用？ 2 请计算酶结合物中HRP与IgG的结合比。（[HRP] 8×4）/[IgG]8=结合比 * * 实验七 HRP结合物的过碘酸钠交联法 二试剂和器材 二试剂和器材 二试剂和器材 三 操作步骤 三 操作步骤 三 操作步骤 四 思考题