分子标记—SNP.ppt

* 分子标记 SNP 什么是SNP SNP的特点 SNP的分类 SNP的检测 SNP的应用 什么是SNP SNP = Single Nucleotide Polymorphism 单核苷酸多态性 基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A, T, C, G) 的变异而引起的多态性 一般而言, SNP在群体中发生频率不小于 1% 从理论上来看每一个SNP位点都可以有4 种不同的变异形式, 包括转换、颠换、插入和缺失，但通常发生的只有两种, 即转换和颠换,二者之比为2 :1 A G G C T A G A A T T C C A T T C G A G T C A G G C T A G A A T T G C A T T C G A G T C 在人类基因组中，CpG二核苷酸的胞嘧啶是最易发生突变的位点, 其中大多数是甲基化的,可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶（C → T） 一个SNP表示在基因组某个位点上有一个 核苷酸的变化，多个核苷酸的变化，即SNPs 在描述SNPs时，当前的一致意见是用术语 haplotype（单体型）代替术语allele（等位基因） 位于一条染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点，被称作单体型 对于所有那些在某一位点是A而不是G的人来说，该位点周围染色体区域上的SNPs状况很可能是一致的。这些变异连锁的区域就是单体型 SNP的特点 位点丰富 SNP是基因组中分布最广泛而稳定的点突变，在人类基因组中大概每1000 个碱基就至少有一个SNP,人类基因组上的SNP总量可达300万个甚至更多 具有代表性 某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素 遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态标记相比, SNP 具有更高的遗传稳定性，因为SNP 是基于单核苷酸的突变，所以其突变率低 易实现分析的自动化 SNP 与传统分子标记方法存在明显不同， 不再以DNA 长度差异作为检测手段，而是直接检测序列变化，从而摆脱凝胶电泳的瓶颈限制，实现高效检测 SNP的分类 根据SNP在基因组分布的位置可分为 基因编码区SNP (cSNP) 总的来说, cSNP比较少,因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5, 但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义,因此倍受关注 根据对遗传性状的影响,cSNP又可分为两种 同义cSNP 即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基的“含义”相同 非同义cSNP 碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列的改变,可能最终影响到蛋白质的功能 基因周边SNP (pSNP） 基因间SNP (iSNP） 基因非编码区SNP 大多数SNP 位于基因组的非编码区，它们对个体表现型是无意义的，但对群体而言，这些SNP 作为遗传标记在群体遗传和生物进化中却有很大作用 SNP的检测 SNP 检测技术按研究对象主要分为两大类 未知单核苷酸突变位点的检测技术 温度梯度凝胶电泳（TGGE） 通过温度的变化，使点突变或正常的DNA片段由于氢键不稳定，造成TM值不同而表现出不同的解链行为。作为一种常用的检测SNP的强有力的工具，TGGE可分析长度在200~900bp内的双链DNA片段，但如果在GC富集区，则SNP检出率则大大下降 Taqman技术 PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团 (quencher) PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光 特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用 (quench)，从而发出荧光 两个探针的5’端标有不同的荧光 (FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型  技术路线图 Multiplex SNaPshot-多重单碱基延伸技术 在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP, 紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止 经ABI测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型 根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SN