实验十二常用血细胞化学染色.doc

实验十二 常用血细胞化学染色 Cytochemistry stain for blood cells 一、过氧化物酶染色 染色原理 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。 试剂器材 1．1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。 2．亚硝基铁氧化锅饱和溶液 在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。 3．1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。 4．稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。 5．瑞氏(Wright)染色液。 6．新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。 操作步骤 1．取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μL，溶液呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。 2．在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染色6min。 3．自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染15~20 min。 4．自来水冲洗，待干，用油镜镜检。 注意事顶 1．血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。 2．TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。 3．H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H202过浓。若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。 4．染色液pH应为5.5。 5．试剂应置于低温暗处，防止因光线照射而失效。 实验评价 1．POX染色是鉴别急性白血病类型最重要最常用的细胞化学染色方法，临床上不管是哪种急性白血病，首先做POX染色，以区分是急性髓细胞白血病还是急性淋巴细胞白血病。如变异型的急性早幼粒细胞白血病极易误诊为急单、急粒中如以小型原粒细胞为主者极易误认为急淋等。在判读细胞POX染色结果前，要先观察成熟粒细胞是否呈强阳性，以判断染色是否成功。 2．POX阳性说明是急性髓细胞白血病(阳性较强常见于急性粒细胞白血病，弱阳性常见于急性单核细胞白血病)；阴性说明各种急性白血病的可能性均有。因原始细胞多表现为阴性反应，故本法对白血病的分型有一定的局限性，特别是对某些分化极差的白血病，可能失去鉴别意义。 3．四甲基联苯胺法操作简单，染色效果较好，试剂无致癌作用，但对染液pH要求较高，如pH5.0会导致假阳性结果。 二、氯乙酸AS-D荼盼醋酶染色 染色原理 血细胞内的氯乙酸AS-D荼酚酯酶(naphythol AS-D chloroacetate esterase, NAS-DCE)水解基质液中的氯乙酸AS-D荼酚，产生AS-D荼酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。 试剂器材 1．10%甲醛甲醇固定液 甲醛 25mL 甲醇 75mL 混合后置4℃冰箱保存。 2．Veronal醋酸缓冲液 甲液： 醋酸钠(含3H2O) 1.94g 巴比妥钠 2.94g 蒸馏水 100mL 乙液： 0.1mol/L盐酸 取盐酸(比密1.190g/L)0.85mL加蒸馏水至100mL。 取甲液50mL，乙液45mL，再加蒸馏水135mL，用1mol/L盐酸调pH至7.5~7.6。 3．基质液 氯乙酸AS-D荼酚 100mg 丙酮 0.5mL 蒸馏水 5mL Veronal醋酸缓冲液 5mL 固酱紫GBC盐 10 mg 不必过滤立即染色，一次用完。 4．苏木素染液。 操作步骤 1．固定 新鲜干燥的涂片在固定液中30 s~1min，蒸馏水冲洗，待干。 2．显示 放入基质液(37℃)30min，自来水冲洗。 3．复染 苏木素染液复染5mn，自来水冲洗，待干，镜检。 注意事顶 1．冬季室温低，茶酚和固酱紫GBC盐不易溶解，可放37℃温箱促溶。 2．茶酚在丙酮中溶解