感染性疾病血清学标志物检验质量保证(简简).ppt

感染性疾病血清学标志物检验质量保证 卫生部临床检验中心 李金明 感染性疾病血清学标志物 肝炎病毒标志物：HBsAg、抗HCV等 抗HIV 梅毒抗体 其它抗原、抗体 检验方法 ELISA 应用酶标原理的自动化分析仪 应用其它标记物的自动化分析仪 RIA 影响ELISA测定的因素 试剂盒的因素 实验操作 影响ELISA试剂盒质量的因素 固相材料:聚苯乙烯塑料 抗原:纯化、合成和基因工程抗原 抗体：多抗、单抗和基因工程抗体 酶结合物：酶免疫测定的核心成份 色原底物：OPD和TMB 运输贮存 酶免疫测定操作中的注意事项 标本的收集、运送和保存 试剂准备 加样 温育 洗板 显色 比色 结果判断 结果报告及解释 可能影响测定结果的标本因素 内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等 外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融 加 样 加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。 从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。 全自动加样系统的标本“交叉污染”问题 温 育 常采用的温育温度有43℃、37℃、室温和4℃等。 温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短。 温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面）或湿盒中，以使反应溶液的温度迅速与室温平衡。 “边缘效应”的排除: 使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。 洗 板 每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有很大关系。 洗板液一般为含0.05% Tween20的中性PBS。 Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团。 洗涤作用机理，借助其疏水基团与固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相 洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验测定下限。 比 色 加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀 测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适 比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定，所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显色具最大光吸收）如450 nm和非敏感波长（所测得的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等所致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测得的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。 ELISA测定的主要问题 HOOK EFFECT 结果的判断 一步法的“HOOK EFFECT”产生的原因 一步法的“HOOK EFFECT”产生的原因 定性免疫测定的CUT-OFF值 酶免疫测定出现假阳性的原因 操作及仪器因素：加样、洗板、自动化加样系统的标本间“交叉污染” 标本因素：RF、补体、异嗜性抗体、动物抗体、动物抗体、高浓度Ig、溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全 酶免疫测定出现假阴性的原因 操作、试剂及仪器因素：标本未加、试剂过期或变质、仪器针孔堵塞、标本“交叉污染” 标本因素：补体、自身抗体、反复冻融 临床免疫检验的室内质控问题 临床免疫检验室内质控不太受重视的原因有三: 一方面可能是质控品来源有限或价格因素；其次是尚没有意识到；再有就是不知从何做起。 使用统一合格的校准品开展室内质控才是解决各实验室结果可比性差同时也是保证检验质量的唯一有效的途径 。 室内质控的内涵并不仅仅是使用质控物进行统计学质控，它包括分析前、分析中和分析后的质量控制三个方面。 免疫检验室内质控既有与临床生化室内质控共性的一面，也有其特性的地方 室内质量控制（IQC） IQC主要包括三个方面： （1）测定前的质量控制； （2）统计学质量控制； （3）质量控制的评价 。 统计学质量控制 理想的室内质控样本的条件 质控物浓度的选择 测定中质控样本的设置、数量及排列顺序 统计学质控的特点 统计质控方法 统计质控方法 基线测定 质控规则的表达方式及定义 Levey-Jennings质控图方法 Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法 累积和 (CUSUM) 质控方法 “即刻法”质控方法 Levey-Jennings质控图 Levey-Jennings质控图基本的统计学含义 稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。