谷氨酰胺代谢调控.ppt

改良方法 对于有机杂酸：可以通过调节溶氧水平来消除； 对于非目的氨基酸：可以采取筛选营养缺陷型或适当添加相应氨基酸的方法来减弱。 综述 现有的代谢调控方式 一．综述 1. 1.谷氨酰胺简介 1.2.谷氨酰胺代谢途径图解 二．现有的代谢调控途径 2.1.代谢相关酶的控制 2.2.代谢途径的控制 2.3.代谢物质浓度的改变 L一谷氨酰胺(L--Glutamine，简称Gin)是由L一谷氨酸的羧基酰胺化而来的一种条件必需氨基酸。它是一种极有发展前途的新药，在临床上主要用于治疗脑神经疾病及消化道溃疡。 1.1.谷氨酰胺简介 H H 1.1.什么是条件必需氨基酸？ 必需氨基酸 非必需氨基酸 条件必需氨基酸 以葡萄糖为原料生物合成L谷氨酰胺，涉及到糖发酵、磷酸己糖支路、三羧酸循环、乙醛酸循环以及谷氨酰胺合成水平和分支氨基酸合成水平的调控。其中从葡萄糖到丙酮酸到a-酮戊二酸再到L谷氨酰胺是谷氨酰胺合成的代谢主流． H H α-酮戊二酸 L-谷氨酸 L-谷氨酰胺 NADPH NADP+ L-脯氨酸 NH3 L-精氨酸 NH3 H 谷氨酰胺合成酶 H 为保证谷氨酰胺的合成，应强化葡萄糖→丙酮酸→ a-酮戊二酸→谷氨酰胺的代谢主流，同时减弱向天冬氨酸、缬氨酸、丙氨酸分枝代谢流的强度． H H 从谷氨酸棒状杆菌的代谢工程着眼，加强谷氨酰胺合成代谢。克隆和表达谷氨酰胺合成代谢的关键酶——谷氨酰胺合成酶(GS)的基因 2.1.1谷氨酰胺合成酶的数量 H 2.1.1谷氨酰胺合成酶（GS）的效能的调节 硫氨酸亚砜(MsO)是谷氨酰胺的结构类似物，很容易被GS误认而与其变构部位结合抑制其活性。 针对这一现像，我们可以使用甲硫氨酸亚砜(MsO)作为筛选剂选育突变株。从代谢角度解除了因谷氨酰胺的积累而造成的对GS的反馈抑制． H H GS的存在形式：未修饰、经腺苷共价修饰的。AMP 共价键 酪氨酸残基 GS(AMP) 腺苷酰基转移酶(Adenylyltransferase，Atase) 腺苷酰化会使GS的活性降低或丧失 铵浓度 铵盐↑ 腺苷酰化程度↑ GS酶活力↓ 因此我们可以利用重叠引物法将GS结构基因的Tyr405突变为Phe405从而除去GS腺苷酰化位点。 H H 2.3.1 葡萄糖浓度 Gln的转化随着葡萄糖的加入量的增加而提高，但从能量偶联效率来讲，葡萄糖的利用率却随葡萄糖的加入量的增加在降低。因此，从经济方面讲，提高葡萄糖的添加量并不是提高Gln转化量的有效途径。 2.3.2谷氨酸浓度 补加Cl-能影响细胞膜的透性，使谷氨酸不易渗出，而转化为谷氨酰胺分泌出来 H 可以看出Gln转化量随Glu浓度的增加而有所提高。这可能是由于谷氨酰胺合成酶的分子结构所致:Glu进人酶活性中心部位很困难。而高浓度的Glu则会增加或加快其进入到酶活性中心部位，促进酶催化反应。但从如图4中也能看到Gln转化率却随着Glu浓度的增加而下降。 H 2.3.3铵盐浓度 NHCI浓度大于4％时对谷氨酰胺的合成会产生明显的抑制作用，主要是因为在过量铵盐的培养条件下，GS腺苷酰化程度增强，GS酶活力下降甚至失活 应对方法：对氮源进行补料发酵，减少铵盐对谷氨酰胺合成酶合成的的阻遏作用； H 策划：林骥晗、王蒙、刘一凡 资料：卢霄崎、杨帆 整理：林骥晗 制作：杨瀛、邢桦彬 展示：刘一凡 茶水：王瀚泽、，毛新宇、甘海威 托儿：王蒙 首先，L-谷氨酰胺的合成需要碳源，碳源由葡萄糖（Glc）提供，然后葡萄糖经EMP途径降解为L-谷氨酰胺合成所需的前体碳单位丙酮酸（PYR）；部分葡萄糖经磷酸戊糖（HMP）途径氧化以提供还原力。 ①葡萄糖（Glc）的运输和消耗是在磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）磷酸转移酶系统（PEP- linked phosphotransferase system，简称PTS）催化下的集团运输。 Glc+PEP→PYR+C6P （1） ②以葡萄糖为氮源时乙醛酸支路活性很低，故可以不考虑乙醛酸途径； ③谷氨酰胺（GLN）的合成： GLU+（NH4+）+ATP→GLN （2） ④菌体生长过程中，铵根离子主要由谷氨酸脱氢酶固定，所以铵根离子由前体α-酮戊二酸（α-KG）、谷氨酸（Glu）和NADPH代替： α-KG+（NH4+）+H20+NADPH→GLU+NADP （3） ⑤谷氨酸（GLU）合成：在NH4+浓度极低的情况下（4）占优势，但由于摇瓶谷氨酰胺发酵NH4+充足，所以直接按照（2）反应，不按（4）反应。 α-KG+GLN+NADPH→2GLU+