[医药卫生]第3章_分离分析技术-1电泳技术-YQ.ppt

晏 琼 2010年11月 第三章 分离分析技术 3.1 电泳技术 3.2 层析技术 3.3 微量分析技术 3.1 电泳技术 电泳技术: 3.1.1 电泳技术总论 一、电泳技术发展史  1809年俄国物理学家Рейсе 首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1909年Michaelis 首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH 的溶液在U 形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 3.1.1 电泳技术总论 1937年瑞典Uppsala 大学的Tiselius 对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius 电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ 球蛋白组成的，由于Tiselius 在电泳技术方面做出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1948年Wieland 和Fischer 重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum 用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。 3.1.1 电泳技术总论 1959年Raymond 和Weintraub 利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。 30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即”电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即”Last Check”。 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。 3.1.1 电泳技术总论 二、电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的 生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸等都具有可电离基团， 它们在某个特定的pH 值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这 些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子 带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不 同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简 单介绍一下电泳的基本原理。 通过扫描光密度仪对染色的凝胶进行扫描可以进行定量分析，确定样品中不同蛋白质的相对含量。 扫描仪测定凝胶上不同迁移距离的吸光度值，各个染色的蛋白带形成对应的峰，峰面积的大小可以代表蛋白质的含量的多少。 另外一种简单的方法是将染色的蛋白带切下来，在一定体积的50%吡啶溶液中摇晃过夜溶解染料，而后通过分光光度计测定吸光度值就可以估算蛋白质的含量。 但应注意，蛋白质只有在一定的浓度范围内其含量才与吸光度值成线性关系，另外不同的蛋白质即使在含量相同的情况下染色程度也可能有所不同，所以上面的方法对蛋白质含量的测定只能是一种半定量的结果。 3.1.10 电泳结果处理 尽管凝胶电泳通常是作为一种分析工具使用，它也可以用于蛋白质的纯化制备。但电泳后需将蛋白质从凝胶中回收，通常是将所需的蛋白质区带部分的凝胶切下，通过电泳的方法将蛋白质从凝胶中洗脱下来（称为电洗脱）。 目前有各种商品电洗脱池装置。最简单的方法是将切下的凝胶装入透析袋内加入缓冲液浸泡，再将透析袋浸入缓冲液中进行电泳，蛋白质就会向某个电极方向迁移而离开凝胶进入透析袋内的缓冲液。 由于蛋白质不能通过透析袋，所以电泳后蛋白质就留在透析袋的缓冲液中。电洗脱后可通一个反向电流，持续几秒钟，使吸附在透析袋上的蛋白质进入缓冲液，这样就可以将凝胶中的蛋白质回收。 3.1.10 电泳结果处理 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法。 对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。 对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 3.1.11