YMDD突变检测.ppt

沈佐君 拉米夫定(Lamivudine) 硫代脱氧胞嘧啶 （2-deoxy-3-thiacytidine，3TC） 核苷类似物 口服抗病毒药物 英国葛兰素威康制药公司推出的贺普丁(heptodin) 在2000年已被国家药品监督管理局批准列入国家基本药物制剂品种目录，1998年被FDA批准用于临床。 拉米夫定的作用 降低HBV－DNA的浓度 改善肝脏组织的病变 可能阻断肝纤维化的进程，终止肝硬化的发展 不受人种、病毒感染的模式、野生型或基因组前C区突变的影响 口服，副作用小 抗病毒机制 竞争性阻断逆转录酶（依赖RNA的DNA多聚酶）活性，有效地抑制HBV的复制 进入细胞的拉米夫定在激酶的作用下可被磷酸化为三磷酸脱氧胞苷，可以与dCTP竞争性掺入延伸的DNA，因它缺乏3羟基而使复制的病毒DNA链终止。 为什么在使用 拉米夫定(Lamivudine) 要进行YMDD检测 ??? 拉米夫定治疗HBV感染治疗过程与YMDD变异关系 YMDD变异的耐药机制 第552位的蛋氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）替代后，使此侧链缩短，结合位点变大，不再适合拉米夫啶结合而导致耐药。 变异株对拉米夫啶的敏感性大大降低。体外实验证实该药物抑制变异株HBV复制的效率可降为对野生株的万分之一。 YMDD突变 Met-----ATG YMDD Val------GTG YVDDYVDD Ile-------ATT YIDD 拉米夫定治疗中的突变发生位点 YMDD编码DNA多聚酶（CODON552） YMDD 野生株：Tyrosine --- Methionine --- Aspartate ---- Aspartate （YMDD）（ 酪氨酸 ） --- （蛋氨酸 ） --- （ 天门氡氨酸）---（ 天门氡氨酸 ） 变异株1：Tyrosine --- Valine -------Aspartate ------- Aspartate （YVDD） （ 酪氨酸 ） --- （缬氨酸 ）--- （ 天门氡氨酸）---（ 天门氡氨酸 ） 变异株2：Tyrosine --- Isole----------Aspartate ------ Aspartate （YIDD）（ 酪氨酸 ） --- （异亮氨酸 ）--- （ 天门氡氨酸）---（ 天门氡氨酸 ） YMDD突变检测常见方法 1. 基因测序法（标准的参考方法） 2. 荧光定量PCR方法（实用的方法） 荧光定量PCR检测YMDD 基本原理：确定探针特定的TM值来区 分是否突变。 常用方法：覆盖突变位点荧光双探针杂交的方 法检测YMDD。 TM值：在核酸加热变性过程中，当双链DNA 解链到一 半时所对应的温度就是该核 酸的TM值，也叫核酸的熔点。每种不 同的核酸有不同的TM值(特征常数)。 影响TM值的主要因素 1.碱基中GC含量，含量越高，TM越大。 2.核酸的长度，核酸越长，TM越大。 3.完全配对比不完全配对时TM值要大。 加热核酸时荧光强度变化曲线，当荧光陡变为0时所对应的温度就是TM值。 同样的核酸序列不同浓度TM值相同 不同核酸TM值不同 YMDD：TM值显示54.64°C YIDD：TM值显示46.91°C YVDD：TM值显示50.74°C 临床资料 项目开展情况 结 论 * * 乙型肝炎患者抗病毒治疗拉米夫定耐药性突变检测 引自J Virol. Metods 1999；83：181-187 8（66.7%）[ 4(33.3%)、4(33.3%) ] 4（33.3%） 12 治疗24个月 9（56.3%）[ 7(43.7%)、2(12.5%) ] 7（43.7%） 16 治疗18个月 12（32.4%）[ 7(19%)、5(13.5%) ] 25（67.5%） 37 治疗12个月 4（11%）[ 2(5.5%)、2(5.5%) ] 33（89%） 37 治疗9个月 33（24%）[ 20(15%)13(9%) ] 106（76%） 139 治疗前 变异[ YVDD、YIDD ] 无变异 （YMDD） 研究例数（例） 治疗过程 YMDD变异检测方法有： 1、测序：金标准，需昂贵仪器设备，成本高，过程复杂 2、基因芯片：技术目前尚未成熟，仍需进一步研究 3、限制性片段长度多态性：目前临床用得最多的是RFLP，但由于病毒变异快速，即使有轻微的碱基变化，就会出现RFLP酶切位点的变化，出现新的酶切位点或原有的酶切位点消失，导致检