umt作为红色荧光报告蛋白在大肠杆菌的功能和可溶性表达word论文.docxVIP

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2018-02-08 发布于上海
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umt作为红色荧光报告蛋白在大肠杆菌的功能和可溶性表达word论文.docx

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umt作为红色荧光报告蛋白在大肠杆菌的功能和可溶性表达word论文

MBPorTEVpconstructs.ThelowexpressionlevelsofsomemaizeproteinsinE.coliweredetectedusingtheUMT reporter,aswellasGFPreporter.TheN-terminalSUMOtag hadthelimitedenhancingproductionofthefusionproteins.Thecoupledselectionofproteinsolubilitybasedonpotassiumtelluriteinhibiting cellgrowthandfluorescencedisplayweredeveloped.Withincreasingconcentrationsof potassiumtellurite,colonynumbersofthemixedcellsexpressingtheselectedsixproteins withdifferentsolubilityweredecreased,butcoloniesdisplayingredfluorescencewas identifiedtobeproducedtheexpectedproteinwithrelativelyhighsolubilityby SDSandWesternblotanalysis.Theselectedfiveenzymesinvolvedinhemeandsirohemebiosynthesisimpacting onUMTreporterwereconfirmed.Thenewfluorescentmaterialfromcellsexpressingthefusionprotein for5-aminolevulinatesynthaseoruroporphyrinogen decarboxylasewas discoveredpreliminarybyUV-visiblescanninganalysis.Otherthreeenzymeshadnotsignificanteffectonthechangeofcellfluorescence.Takentogether,thedifferentplantUMTproteinsastheN-orC-terminalfusion partnerareappliedformonitoringthefunctionalandsolubleexpressionlevelsinE.coli. Thelimitsofitsapplicationarealsoidentified.OurdevelopedreportersystemwillprovidetheefficientselectionofproteinsolubilityinE.coli.Kewords:UroporphyrinogenIIImethyltransferase(UMT),redfluorescencereporter, application,E.coli.III目录摘要IAbstractII目录IV1 文献综述11.1 荧光蛋白的种类11.1.1 自发荧光蛋白11.1.2 依赖辅基的荧光蛋白21.1.3 结合或催化产生荧光分子的蛋白21.2 血红素和西罗血红素的生物合成途径22 引言52.1 研究目的与意义52.2 研究内容53 材料与方法63.1 材料63.1.1 菌株来源63.1.2 质粒来源63.1.3 基因来源63.1.4 主要试剂63.1.5 主要试剂及缓冲液的配置63.2 仪器与设备73.3 实验方法73.3.1 表达载体构建73.3.2重组表达野生型大麦UMT 及其突变体的菌斑荧光观察93.3.3野生型大麦UMT 及其突变体重组细胞破碎上清液的光谱扫描93.3.4重组表达野生型大麦UMT 及其突变体的细胞荧光强度检测93.3.5野生型大麦UMT 及其突变体表达水平的定性与定量分析93.3.6表达大麦UMT 及其突变体在不同条件下的细胞荧光强度10IV3.3.7野生型大麦UMT 及其突变体指示蛋白质的生理功能103.3.8玉米UMT 指示靶蛋白的水溶性113.3.9表达玉米UMT 融合蛋白的重组细胞在不同条件下的荧光强度113.3.10玉米UMT 作为双功能报告蛋白的研究123.3.11UMT上下游代谢相关酶对玉米UMT 作为报告蛋白的影响124 结果与分析134.1大麦bUMT与mbUMT的氨基酸序列比对134.2表达野生型大麦UMT 及其突变体的重组菌斑荧光观察134.3表达野生型大麦UMT 及其突变体重组细胞破碎上清液光谱扫描144.4表达野生型